第十二章其他分子诊断检测技术要点分析.ppt

第十二章 其他分子诊断检测技术 临床生物化学教研室 付祖姣 博士 目 录 第一节 基因变异检测技术 第二节 脉冲电场凝胶电泳 第三节 分子影像 第一节 基因变异检测技术 检测已知的基因突变 检测未知的基因突变 几种常见的基因变异检测方法 PCR扩增阻碍突变系统 寡核苷酸连接实验 温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳 变性高效液相色谱法 错配接合蛋白质截短测试法 一、PCR扩增阻碍突变系统(PCR amplification regractory mytation system, PCR-ARMS) 以PCR方法为基础，检测已知点突变的一种方法。 又叫做PCR等位基因特异性扩增法（PCR amplification of specific alleles, PASA） 或等位基因特异性PCR (alleles-specific PCR, ASPCR) （一）基本原理 PCR的引物3’末端的核苷酸与模板之间存在错配时，PCR扩增效果差，或者不能扩增。 设计2对引物，一对引物（P1）与正常基因完全匹配，一对引物(P2)与突变基因完全匹配。 用这两对引物分别扩增模板。 如果模板基因为正常基因，那么P1扩增可以得到大量产物，而P2无产物。 如果模板已经突变，那么P2扩增可以获得大量产物，而P1无产物。 （二）应用 检测单一点突变 基因分型 检测多位点突变 1. 检测单一点突变 设计一对引物，可以扩增突变基因而对正常基因呈扩增阻遏； 附加一对引物，可以扩增标志性基因作为阳性对照； PCR扩增完成，进行电泳，即可得知点突变是否发生。 2. 基因分型 可用于单个突变的基因分型（鉴别杂合子和纯合子）或多态性分析 3. 检测多位点突变 （三）方法学评价 适用于较少点突变的检测； 具有低-中等批量处理能力； 可借助多重PCR检测多个点突变； 无需放射性标记； 无需昂贵的试剂； 无需复杂的检测系统 （一）基本原理 嗜温性或耐热的连接酶具有高特异性和高保真性，它能连接与模板序列完全互补的两段核苷酸片段。 双等位基因变异的检测 OLA实验的操作 耐热连接酶，可使变性和连接连续进行，产物呈线性增长，大大增加了检测的灵敏度； 若PCR扩增引物的Tm值大于探针的Tm值，可在同一管内先进行PCR，再进行OLA实验，大大减少了污染，提高检测效率。 （二）临床应用 镰状细胞贫血症的分子诊断、产前检查 多种遗传病及常见病的检测 (P168)； 局部地区人群的遗传病分子检测 （三）方法学评价 能可靠地鉴别基因型及纯、杂合子； 不容易产生假阴性和假阳性结果； 利用耐热连接酶循环进行连接，使信号放大，更增强了该法的灵敏度 三、温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳 利用不同的分子在不同浓度的变性剂作用下，失活而改变分子构象，进而进行分离的一种电泳技术。 （一）TGGE的基本原理 普通的非变性凝胶电泳不能分离具有相似长度的DNA，所以也不能分离发生了单核苷酸突变的DNA序列。 但是在温度梯度凝胶电泳中，随着温度的逐渐升高，DNA分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链DNA分子表现出一种复杂的分枝构象，使得其电泳迁移率大大下降。 （四）临床应用 广泛应用于疾病基因的突变检测，尤其是一个等位基因发生突变就会引起的疾病检测； 筛选人类基因的多态性； 人类基因的突变检测，如P53、FBN1等基因； 线粒体DNA中的基因突变及多态性检测； 粪便及肠内微生物多态性的鉴定； 病毒基因组的突变鉴定及不同病毒株之间的基因组差异鉴定。 （五）方法学评价 高分辨率，能100%检出对单个碱基突变的基因； 结合GC夹、补骨脂素夹或双边夹，可提高其灵敏度，获得更高的检出率。 四、变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC) 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，其原理是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 高效液相色谱：以液体为流动性，高速、高效率地分离混合物的一种色谱技术。 变性高效液相色谱：改进传统高效液相色谱的分离系统，并运用变温分析方式，高效分离各种生物大分子（包括DNA）的一种方法。 （一）DHPLC的基本原理 DHPLC的分离系统 DHPLC分离DNA的原理 DHPLC检测突变的原理 （二）临床应用 乳腺癌相关基因BRCA1、BRCA2及ATM等疾病相关基因的分子检测； 短的串联重复序列的基因分型； 肿瘤样本中杂合性缺失的检测； Y染色体和常染色体DNA序列的筛查 酵母