基因工程复习资料要点.docVIP

绪论 第一节The birth of Genetic Engineering 一．基因工程的定义 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌 体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 二．基因工程诞生的理论基础 1.DNA是遗传物质 （1）肺炎双球菌转化实验 （2）噬菌体转染实验 2.DNA双螺旋结构 三．基因工程诞生的技术突破 1.限制性内切酶（restriction enzymes） 2. DNA连接酶（ligase） 3.载体（vector） 4.感受态体系(competence) 5.琼脂糖凝胶电泳 6.DNA测序技术 四．基因工程的诞生 1.Berg的开创性实验 2. Boyer-Cohen实验 六．基因工程的特征 1.跨物种性 2.无性扩增 七．基因工程的主要操作内容 1.目的基因的获取 2.重组体的制备 3.重组体的转化 4.克隆鉴定 5.目的基因表达 第二节基因工程的安全性 基因工程的安全隐患 1.对环境的影响 2.新型病毒的出现 3.癌症扩散 4.人造生物扩散 二、重组DNA研究的安全准则 1.公众的担忧 2.专家的态度 3.制定安全规则 4.基因工程的安全措施 （1）实验室的物理安全 分4级：P1—P4级。 （2）实验室的生物安全 分3 级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。 （3）载体的安全 第三节基因工程的应用 基因工程在农业生产中的应用 1.提高植物的光合作用效率 （1）提高CO2的固定率 （2）提高光能吸收率和转化率 2.提高豆科植物的固氮效率 3.转基因植物 4.转基因动物 二、基因工程在工业中的应用 1.纤维素的开发利用 2.酿酒工业 三、基因工程在医药上的应用 1.用转基因植物或动物生产药物 2.用微生物生产药物 3.技术设计高效高特异性的生物制剂 4.研制疫苗 5.基因诊断 6.法医鉴定 7.基因治疗 四、基因工程在环境保护中的应用 1.检测水污染 2.生物降解 第四节基因工程技术的商业化发展 一、商业投资支持现代生物技术研究 二、基因工程商业化特点 1.技术密集型 （1）产品来源于实验室 （2）科学家往往就是公司的领导人 2.市场扩张迅速 3.投入巨大 4.风险太高 5.产品不断增加 6.研究专一、产品专一 7.医学生物技术产业进展最快 8.专门为基因工程实验提供研发试剂的公司 第一章基因工程的主要技术原理 第一节DNA的提取与纯化 一、质粒DNA的提取 1 .碱抽提法提取质粒DNA （1）原理 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快； 染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。 （2）所用的试剂作用 ①溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的β-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 ②葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA受机械力（震荡）的作用而降解。 ③EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的 活性，防止DNA被酶降解。 ④NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件， 使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并 结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质 （包括DNA酶）变性沉淀。 ⑤NaAc-HAc缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 ⑥乙醇 用于沉淀DNA。 ⑦RNaseA 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑧TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 ⑨酚 -氯仿 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋 白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第一步：溶菌 使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复 合物和染色体DNA、RNA沉淀。 第四步：离心除去沉淀 上清液中含有闭合质粒DNA。 第五步：纯化DNA 上清液过柱或酚-氯仿抽提。 第六步：沉淀DNA 2. 影响质粒DNA产量的因素 （1）受体菌株 一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌 菌株。 （2）质粒拷贝数 这是直接决定DNA产量的重要因素之一。质粒本身的性质所决定。 （3）质粒大小 分子量大的质粒，拷贝数少。 二、基因组或其他DNA的提取 1.细菌基因组DNA的制备 （1）细胞裂解 10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。不用NaOH! （2）DNA纯化 CTAB(十六烷基