酶免疫技术3要点分析.pptVIP

酶免疫技术 第一节 酶免疫技术的特点 基本原理： Ab+E Ab-E+Ag AgAb-E+底物 显色 Ag+E Ag-E+Ab AgAb-E+底物 显色 该实验利用了酶催化底物的生物放大作用，可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。 主要试剂:酶标记的抗体或抗原 酶标物特点:免疫学活性不变;酶对底物的催化 活性不变。 第二节　酶免疫技术分类 第三节　酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)  　 2、竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） 3、竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 捕获法 捕获法原理 + - E E E E E 1、固相化抗人 　IgM 1、固相化抗人 　IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色 * * * 相结合的技术 酶标记免疫技术又称酶免疫技术： 抗原抗体反应的特异性 酶促反应的专一性 应用评价： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染，不需特殊设备。 易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。 辣根过氧化物酶 （HRP） 从辣根菜中提取的，糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基），主酶与酶活性无关， 辅基是酶的活性中心。 优点：分子量小，标记物易透入细胞；标记方法简单；溶解性好； 价格低且有商品供应；底物种类多。 由于有以上优点，因此，是ELISA最常用的酶 。 常用酶 酶和酶作用底物 HRP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRP DH2为供氢体习惯上被称为底物，底物有多种 酶和酶作用底物 HRP催化的反应式 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。 常用的是 过氧化氢（H2O2)和过氧化氢尿素（CH6N2O3) ，过氧化 氢很不稳定需用前临时配制。过氧化氢尿素配制成应用 液可长期保存。 HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS 常用底物 酶和酶作用底物 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 　HRP的常见底物 酶和酶作用底物 ELISA试剂盒有两种液态试剂A（过氧化氢），B（TMB），如出现颜色改变应废弃。 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 二、酶标记抗体或抗原 酶+抗体（抗原） 抗体（抗原） 化学反应结合 或免疫反应结合 酶 抗体（抗原）特异性不变，酶活性不变。 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 三、固相载体 要求 结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济 种类 塑料制品 微颗粒（免疫磁珠） 膜载体（微孔滤膜） 固相载体 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均 相 异 相 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 抗原抗体反应后需将 结合的与游离的酶标 记物分离后才能 测定 不需将结合的与 游离的酶标记物 分离，即可测定 组织切片或其它标 本中抗原的定位 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 酶联免疫吸附试验ＥＬＩＳＡ（常用） 斑点—ELISA 斑点酶免疫渗滤实验 免疫印迹法 高灵敏度ELISA BAS- ELISA 派生出 酶免疫技术的分类 酶免疫组织化学技术 酶免疫测定技术 均相测定技术 异相测定技术 液相法 固相法 —夹心法 —捕获法 竞争性ELISA 非竞争性ELISA —间接法 酶放大免疫测定技术 克隆酶供体免疫分析 平衡法；非平衡法 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体