基因打靶技术资料.ppt

具体的实施过程有两种策略：一种是通过两次打靶分别将两个LoxP位点引入靶位点。中靶的克隆转染表达Cre酶的质粒，去除两个LoxP位点之间的序列；另一种是第一次中靶的克隆直接转染第二次的打靶载体和Cre酶表达质粒，直接筛选最终中靶的克隆。两种方法都得到了嵌合体小鼠。 Justice等用此系统研制了携带毛色基因标记的染色体组大片段缺失的突变小鼠。 （2） Cre-LoxP介导的姐妹染色体间的重排 哺乳动物细胞中有相当数量的基因是多拷贝的，这些多拷贝的基因在染色体上排列在一起形成基因簇。基因簇中的基因具有相同或相似的功能。用基因打靶的方法研究这些基因的功能必须使这些基因同时产生突变。如果基因簇内的各基因的遗传距离较大，可以分别在每一个拷贝上引入突变，通过子代的杂交获得每个拷贝同时带有突变的个体。但当基因簇内的各基因间的距离很小时，染色体交换的频率非常低，无法通过子代杂交获得各拷贝同时带有突变的个体。用Cre-LoxP系统可以实现这一目的。 具体的实施策略是将两个LoxP序列通过同源重组分别引入到两个基因中去，得到两个分别带有LoxP序列的小鼠品系。两个品系杂交，就会得到在两条姐妹染色体上同时带有LoxP序列的小鼠，再和表达Cre酶的第三个小鼠品系杂交便可获得两个拷贝同时删除的子代。Matsuaka等将编码肾素基因簇内的两个基因ren1和ren2用此方法同时灭活获得了成功。 Cre介导的非同源染色体间的重排人类的许多遗传疾病是由于染色体的易位引起的，应用Cre-LoxP系统成功地建立了相应的动物模型。其原理是，将LoxP序列分别引入到非同源染色体上，在Cre酶的存在下诱导非同源染色体之间的重组。Van Deursen等通过两次连续的基因打靶将两个LoxP序列分别引入到小鼠ES细胞的13号染色体的DEK和2号染色体的Can基因中，两次中靶 ES细胞转染超螺旋结构的编码Cre重组酶的质粒，得到了染色体易位的ES细胞。 （七）诱导性基因打靶 （1）诱导性基因打靶原理它主要由Cre/loxP及诱导系统组成。Cre／loxP系统由重组酶Cre和该酶的特定作用位点loxP组成，其中的重组酶Cre可诱导LoxP所在的DNA发生缺失、插入、重复、倒位和易位等多种形式的基因突变或染色体畸变。诱导性基因打靶就是以该系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制、或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。 （2）诱导性基因打靶的类型 根据所用诱导剂的种类，诱导性基因打靶可分为四环素诱导型、干扰素诱导型（二者所用诱导剂为控制Cre基因表达的启动子活性的活化物)和激素诱导型(所用诱导剂为Cre酶活性的激活物)等几种类型。 以Cre／loxP系统介导的位点特异性重组为基础的诱导性基因打靶术的优势： ①诱导基因突变的时间可人为控制； ②可避免因基因突变而致死胎的问题； ③在2个loxP位点之间的重组率较高； ④如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。 （八）基因敲入（Gene Knockin） 通过基因打靶，用一种基因替换另一种基因以便在体内测定它们是否具有相同功能。也可通过该技术进行靶向基因治疗。与基因敲除不同之处在于：设计载体时将靶基因第一外显子N端缺失并将新的替换基因置于靶基因的调控序列之下。 七、基因打靶的影响因素 基因打靶的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的细胞数与转染的细胞总数之比，又称同源重组效率。基因打靶效率在不同的研究报道中变动范围较大，其波动性来自较多的影响因素。 (1) 打靶载体的影响 打靶载体中同源序列是决定同源重组效率的关键因素，Thomas和Capecchi研究表明，当载体同源序列长度从4kb增加至9kb时，基因打靶效率增加10倍，与此同时，非同源重组效率增加40倍。Zimmer等用显微注射法将含20kb同源重组序列的载体插入小鼠基因组，破坏了 Hox1.1基因，其效率是1/150。Hasty等研究发现，同源序列达一定长度后，继续的增加对同源重组效率不产生显著影响。 (2) 外源DNA导入方式的影响 目前，外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒感染法。不同的导入方法对同源重组效率有明显影响。目前应用最广的是显微注射法，用显微注射法导入可得到很高的转染率，占接受外源DNA细胞的10~20%，但显微注射每次只能注射一个细胞，而用电穿孔法可同时使许多细胞得到转染，可使1%的ES细胞稳定转染。 1993年，