人病原体难辨梭状杆菌中钴铁硫蛋白的克隆-urop复旦大学本科生.doc

人病原体难辨梭状杆菌中钴铁硫蛋白的克隆、表达、纯化、以及甲基转移活性研究 化学系 张思学 指导教师 谭相石 摘要：本实验探索了一套有效的克隆、表达、纯化和体外重组具有生物活性的难辨梭状杆菌（Clostridium Difficile）中钴铁硫蛋白的方案。钴铁硫蛋白的两个亚基CfsAcd和CfsBcd分别构建入MBPHT-mCherry2和pETDuet-1载体，在大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达。其中CfsAcd采用了MBP标签可溶性表达，CfsBcd采用了包涵体提取的方法。利用Ni-TNA柱纯化后的两个亚基再体外组装钴胺素和铁硫簇[Fe4S4]。经过对重组的钴铁硫蛋白进行的ICP-AES金属含量分析、紫外可见光谱表征、和stopped flow快速反应动力学测定，证明了所重组得的蛋白结构正确，具有甲基转移的生物活性。 关键词：难辨梭状芽孢杆菌；Wood-Ljungdahl代谢通路；钴铁硫蛋白；[Fe4S4]立方簇；钴胺素；大肠杆菌异源表达；甲基转移活性 Abstract The corrinoid iron-sulfur protein consists of two subunits, a cobalamin cofactor, and a [Fe4S4] cluster. The genes encoding subunit γ and δwere recombined with vector MBPHT-mCherry2 and pETDuet-1 respectively . They are expressed in E. coli. strain BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. Subunit γ was obtained by soluble expression with an maltose-binding protein(MBP) fusion tag. Subunit δwas extracted from inclusion bodies. Proteins were purified by Ni-TNA column and gel filtration column. After reconstitution of [Fe4S4] and cobalamin, the corrinoid iron-sulfur protein can be obtained. The characterizations include ICP-AES, UV-vis, and stopped flow kinetics. It can be proved that the reconstituted corrinoid iron-sulfur protein has correct structure and methyltransfer activity. Keywords Clostridium Difficile; Wood-Ljungdahl pathway; Corrinoid iron-sulfur protein; [Fe4S4] cluster; Cobalamin; E. coli expression system; Methyltransfer activity 前言 难辨梭状杆菌(Clostridium difficile)是公认的医院内感染和抗生素相关性腹泻最重要的病因。进入21世纪以来, 艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)的发病率和疾病的严重程度在全球范围内呈上升趋势。 2001年后, 在北美、澳大利亚及欧洲等国家, 出现了C.difficile 的高毒力菌株BI/NAP1/027/毒素Ⅲ型。C.difficile 相关性腹泻(Clostridium difficile -associated diarrhea, CDAD)的地区播散性暴发流行[1,2], 常导致住院患者的病死率大幅升高。 CDI已成为一个严重的公共卫生问题[3-5]. 难辨梭状杆菌又称艰难梭菌, 是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌, 可存活于水、土壤等自然环境、动物体内及医院环境中, 其芽孢在医院环境及医务人员手上可存活6个月[3]。1935年, Hall和OToole首次从健康的新生儿粪便中分离出该菌,目前发现1%-3%的健康成人、40%-60%的新生儿、16%-35%的住院患者粪便中携带此菌[6]。C.difficile 通常产生两种主要毒素: 毒素A是一种肠毒素, 对白细胞有趋化作用, 主要引起肠道炎症、液体分泌和黏膜损伤, 也有一定的细胞毒性作用。毒素B是一种细胞毒素, 可刺激单核细胞释放炎性细胞因子, 对