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2聚合酶链式反应(PCR)扩增.ppt
聚合酶链式反应(PCR)扩增 [实验目的] 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 [实验原理] 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。 [仪器、材料与试剂] 仪器 PCR热循环仪 琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像系统 材料 DNA模板 4种dNTP 引物1、引物2 Taq酶 琼脂糖 DNA相对分子质量标准物 吸头、小指管 试剂 1、10×缓冲液 500mmol/l KCl;100mmol/l Tris?HCl(pH8.3 ,室温) 0.1% 明胶 2、 15mmol/l MgCl2 3、 DNA模板 1ng/μL 4、 4×dNTP 1mmol/l dATP ;1mmol/l dCTP;1mmol/l dGTP;1mmol/l dTTP 5、 引物1 引物溶液浓度 10pmol/μl 引物2 引物溶液浓度 10pmol/μl 6、 Taq酶 1U/μL [实验步骤] 在0.5ml Eppendorf管内配制25μL反应体系： 反应物 体积/μL 10×buffer 2.0 dNTP 1.0 引物1 1.0 引物2 1.0 Taq酶 0.5 Template 1 ddH2O 13.5 总体积 20 按下列程序进行扩增： ①、95℃预变性 5min ②、95℃变性 1min ③、55℃退火 2min ④、72℃延伸 3min ⑤、重复步骤②~④30次； ⑥、72℃延伸 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制0.7%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电流40mA。电泳结束后，紫外灯下观察结果。 [注意] 1.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 2.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 3.应设含除模板DNA所有其它成分的阴性对照。 * *
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