现代分子生物学技术基础解读.ppt

第四章 现代分子生物学技术基础 随着科技发展,对各种生命现象的认识已深入到分子水平,现代分子生物学技术是必备工具. 多年来,已发展了许多分子生物学技术，新的技术还在不断出现,从不同水平探索生命的奥秘，核酸分析相关技术是分子生物学技术的重要基础. 分子生物学技术 DNA克隆：采用细胞—DNA克隆或PCR—DNA克隆技术，选择性地制备目的DNA，用以分析其结构和功能。 DNA、RNA、蛋白质分析：特异性地检测DNA、RNA、蛋白质的特性和功能。 主要内容 1 DNA克隆 ： 细胞- DNA克隆 PCR- DNA克隆 2 DNA、RNA、蛋白质分析方法： 分子杂交 突变筛查 DNA测序 芯片 DNA-蛋白质作用检测等 目 的 1）了解细胞-DNA克隆的主要步骤 2）掌握限制酶和载体的一般特性以及 常用载体的种类。 3）掌握 PCR的基本原理。 4）掌握分子杂交（Southern)的基本原 理、步骤及应用。 5）了解突变检测的方法和 DNA测序等 1. DNA 克隆 克隆的概念 克隆(clone)：是指用无性繁殖的方法产生与亲代完全相同的子代个体或群体。 分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 1. DNA 克隆 DNA克隆是特异DNA片段或基因的选择扩增 细胞—DNA克隆：利用细胞内的DNA复制机制 PCR—DNA克隆：细胞外或体外多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 1.1细胞—DNA的克隆 实现DNA克隆所采用的方法及相关工作 又称为重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）: 人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组形成重组DNA分子,然后将其导入特定的宿主细胞,使其扩增得到大量相同的DNA片段,用于进一步研究;或表达相应的基因产物，使宿主细胞获得新的遗传特性。 重组DNA技术(基因工程或遗传工程)，兴起于20世纪70年代。人类实现对基因进行自如地操作、转移和改造的理想，是在限制性核酸内切酶、载体、连接酶和其它修饰酶被陆续发现以后才得以实现. 1.1.1 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 70年代早期，发现细菌中存在能切割双链DNA的酶，限制外源DNA进入细菌内，称为限制性核酸内切酶（限制酶）。 迄今已从不同细菌中分离了300多种限制酶，其发现和应用促进了重组DNA技术的发展。 限制酶分类 几乎所有原核生物都含有限制酶，根据 结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切点不固定 Ⅲ型切割位点在识别位点之外 Ⅱ型特异性切点位置可以控制和预测， 产生固定的DNA片段，重组DNA技术中所用的限制酶均为Ⅱ型。 限制酶命名 命名原则：根据限制酶来源的微生物学名命名。 第1个字母大写（斜体）代表该酶宿主菌的属名 第2、3个字母小写（斜体）代表该酶宿主菌的种名 第4个字母大写（斜体）代表该酶宿主菌的株。如果从一个菌株中发现了几种限制酶，根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 从Escherichia coli RY13 中第Ⅰ个分离的限制性酶 EcoRⅠ 限制酶识别序列 限制酶 切断DNA分子磷酸二酯键的核酸酶。 限 制 酶主要特征 1 特异识别4~8碱基对，通常为回文序列，即DNA双链从5′→3′方向碱基顺序相同。 2 切断DNA分子磷酸二酯键 3 限制片断末端： 平末端（blunt ends）：切割点在对称轴上 粘性末端（cohesive ends）：交错切割DNA 5′突出粘性末端 3′突出粘性末端 产生相同突出末端的DNA片段，可有三种方式： ① 用相同的限制酶 ② 用识别序列相同的不同限制酶 即同裂酶 (isoschizomers)； ③ 用识别不同序列但产生相同粘性末端的 限制酶；如BamHI和MboI。 不同限制酶切割产生的限制性片段 1.1.2 载体 载体及其特征 （1）载体(vector)定义：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 2）载体 载体特征： ①分子量小，以容纳较大的外源DNA ； ②有多种限制酶单一识别序列，有助于外源 DNA片段插入； ③载体D