马链球菌兽疫亚种类M蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及有效性验证技术报告.docVIP

马链球菌兽疫亚种类M蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及有效性验证 Construction and Confirmation availability of a Bait Vector Containing Streptococcus Equi Ssp. Zooepidemicus M-like Protein Gene in Yeast Two- hybr id System 张言召 李明 盐城生物工程高等职业技术学校 江苏 盐城 224051 摘 要：根据已发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus) ATCC35246株的类M蛋白基因序列，设计和合成一对引物，并以ATCC35246株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出去掉信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至酵母双杂交系统的表达质粒pGBKT7中，构建诱饵质粒。重组质粒通过酶切鉴定和测序后转化入酵母菌株Y2HGold进行表达，融合蛋白经自激活、毒性及Western blot检测，结果显示，构建的诱饵蛋白满足酵母双杂交系统的要求。 关键词：马链球菌兽疫亚种；类M蛋白；酵母双杂交；诱饵载体；构建 马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus)为兰氏分群中的C群链球菌，与马链球菌马亚种(Streptococcus equi ssp. equi)和马链球菌类马亚种(Streptococcus equi ssp. equisimilis)同属于马链球菌。该菌没有宿主专嗜性，容易发生变异，来源不同的菌株抗原性有可能不同。一般情况下，该菌存在于宿主动物的扁桃体以及上呼吸道粘膜表面，为一种粘膜表面的机会共栖菌[1,2]。该菌可通过消化道、外伤、手术、注射疫苗或治疗等途径感染多种动物，并引发多种动物的败血症、脑膜炎、心内膜炎、乳房炎、关节炎等疫病[3-5]。人与发病动物密切接触或食用被该菌污染的食物后，亦可引发该菌感染[6-8]。马链球菌兽疫亚种引起的动物疫病呈世界性分布，但不同区域流行又有各自的特点。在欧美地区，该菌主要引起马、奶牛和羊的发病[9]；在中国，马链球菌兽疫亚种主要引起猪的链球菌病，是我国猪链球菌病(swine streptococcosis)的主要病原。类M蛋白作为该菌的重要毒力因子及主要保护性抗原，在该菌的致病过程中的有着重要作用。具有多种生物学功能，能介导马链球菌兽疫亚种与宿主细胞的发生粘附[10]；与机体中血浆内的一种重要调节蛋白H因子结合后，可抑制补体C3b对链球菌的吸附；另外，类M蛋白的N末端带有负电荷，可排斥膜表面带负电荷的吞噬细胞（如单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞等），抑制此类吞噬细胞对其的吞噬作用[11,12]。类M蛋白容易发生变异，不同宿主来源、不同临床症状分离获得的兽疫亚种菌株的类M蛋白差异较大。本文以马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株类M蛋白为研究对象，成功构建了酵母双杂交系统所需的重组酵母表达载体，为用酵母双杂交系统筛选与类M蛋白有相互作用的蛋白奠定了基础。 材料 酵母表达载体pGBKT7、酵母菌株Y2HGold[基因型：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2 : : GAL1UAS–Gal1TATA–His3, GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2 URA3 : : MEL1UAS–Mel1TATA AUR1-C MEL1]均购自Clontech公司(Japan)；DH5α E.Coli感受态细胞 [基因型：F-ψ80 lacZΔM15Δ (lacZYA-argF) U169 endA1 recA hsdR17(r-k,m-k) supE44λ- thi-1 gyrA96 relA1 phoA]购自TIANGEN公司；马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株为实验室保存菌株。 X-α-Gal、Aureobasidin A、GAL4 DNA-BD Monoclonal Antibody、质粒转化酵母试剂盒Yeastmaker? Yeast Transformation System 2、各种酵母培养基均购自Clontech公司(Japan)；细菌基因组提取试剂盒Genomic DNA mini Kit、胶回收试剂盒Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit、细菌质粒小量提取试剂盒High-Speed Plasimad mini Kit 为Geneaid 公司产品；2×TaqMasterMix购自南京博尔迪生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、各种DNA分子量Marker均购自TaKaRa公司；卡那霉素(Kanamy