微生物致病菌鉴别作业指导书技术报告.docVIP

诺斯贝尔（中山）无纺日化有限公司 微生物致病菌鉴别作业指导书 目的 建立检验致病菌具体操作规程，确保检验操作规范化。 适用范围 适用于化妆品微检致病菌检验过程中发现可疑菌落的进一步鉴别。 依据 根据《化妆品卫生规范》现行版项下编写。 职责 品管部微检员负责执行此规程，并不断完善之。 程序 5.1 粪大肠菌群： 5.1.1 定义： 粪大肠菌群是一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃±0.5℃培养24h~48h，能发酵乳糖产酸并产气。 5.1.2培养基和试剂： （1）双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基 （2）伊红美蓝（EMB）琼脂 （3）蛋白胨水（作靛基质试验用） （4）靛基质试剂 柯凡克试剂：称取5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中，缓慢加入浓盐酸25ml。 （注：配制需在通风柜内进行） 试验方法：接种细菌于蛋白胨水（作靛基质试验用）中，于44℃±0.5℃培养24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂0.3ml~0.5ml，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。 注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买回来后，都应先用已知菌种鉴定后方可使用。（若购入的是蛋白胨水培养基，则可以直接使用。） 5.1.3操作步骤： 5.1.3.1将待检样品按1:10稀释成检液，吸取10ml检液，加到10ml双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h~48h，如不产酸也不产气，则可报告为粪大肠菌群阴性。（见图1） 图1 阴性 阳性 双倍乳糖胆盐培养基 5.1.3.2如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养箱中培养18h~24h。 同时取该培养液1~2滴接种至蛋白胨水（作靛基质试验用）中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h±2h。 经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。（见图2） 图2 阴性 阳性 伊红美蓝培养基 5.1.3.3挑取上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检。（见图3） 粪大肠菌群镜检图片：图3 阴性 阳性 5.1.3.4在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性者液面呈试剂本身颜色。（见图4） 图4 阴性 阳性 靛基质试验 5.1.4检验结果报告： 根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。 5.2金黄色葡萄球菌： 5.2.1 定义： 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。 该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症。 5.2.2培养基和试剂： （1） SCDLP液体培养基 （2） Baird-Parker琼脂培养基 （3）血琼脂培养基（血平板） （4）甘露醇发酵培养基 （5）冻干血浆 （6）卵黄亚碲酸钾增菌剂 5.2.3 操作步骤： 5.2.3.1增菌：将待检样品按1:10稀释成检液，吸取10ml检液到90ml SCDLP液体培养基中，置36℃±1℃培养箱中培养24h±2h。（见图5） 增菌培养：图5 阴性 阳性 SCDLP液体培养基 5.2.3.2分离：Baird Parker琼脂培养基经灭菌后，冷却至50℃左右，取卵黄亚碲酸钾增菌剂1支加入47.5ml培养基中，摇匀后倾注平板。从上述增菌培养液中，取1~2环划线接种于Baird Parker琼脂培养基，如无此培养基也可划线接种至血琼脂平板，置36℃±1℃培养箱中培养24h~48h。 1）在血琼脂培养基上菌落呈金黄色，大而凸起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。（见图6） 图6 阴性 阳性 血琼脂平板 2）在Baird-Parker琼脂培养基上菌落呈灰到黑色，边缘为淡色，圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2mm~3mm，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36℃±1℃培养24h±2h。（见图7） 图7 阴性 阳性 Baird-Parker琼脂培养