质粒的提取及遗传多样性技术报告.docVIP

实验1 普通PCR 一、实验目的： 学习PCR和琼脂糖凝胶电泳实验，重点掌握其操作流程。 二、实验材料与仪器： PCR仪器，母液，菜心DNA模板，琼脂糖，水平电泳仪，UV紫外凝胶成像系统 三、实验方法与步骤： 配母液：加H2O 5.5μL,前向F引物1μL，反向R引物1μL,10x buffer 缓冲液1μL，dNTP 0.4μL，Taq酶0.1μL 加入DNA模板，离心混匀。 设定SSR PCR 扩增程序为 94℃ 5min（预变性）→[94℃45s→55℃45s→72℃1min]35个循环→72℃5min（后延伸） 制备琼脂糖凝胶： 称取0.8g琼脂糖置于三角烧瓶中，加80mlTBE，放入微波炉加热至无晶体溶液→待冷却至60℃，加入0.5μL溴化乙锭EB，轻轻摇匀→导入预先洗净、干燥并且已经放入胶板，胶梳的胶池中（不能有气泡），冷却凝固30min。 上样： 两手垂直向上拔去胶梳，把凝固好的胶片推入电泳槽中，加适量的TBE使其掩盖胶片→在经PCR扩增的样品中加入1μL的溴酚蓝（Loading buffer）离心摇匀→用移液枪上样 电泳：设置电压110V，时间30min，以指示带不跑出凝胶为最长时间参考 四、实验结果与分析： 图1 DNA PCR后的电泳结果 分析：同一样品，在某处都有条带。从Marker 可以确定该条带大概为200bp。 实验2 菌液PCR 一、实验目的： 学习菌液PCR和蓝白斑筛选单菌落实验，重点掌握其操作流程。 二、实验材料与仪器： PCR仪器，母液，菌液DNA模板（21，22,127,131号），琼脂糖，水平电泳仪，UV紫外凝胶成像系统,LB培养基，超净工作台 三、实验方法与步骤： 1、配母液：加H2O 4.2μL,前向F引物0.2μL，反向R引物0.2μL,10x buffer 缓冲液1μL，dNTP 0.3μL，Taq酶0.1μL 加入菌液DNA模板2μL，离心混匀。 设定SSR PCR 扩增程序为 94℃ 5min（预变性）→[94℃30s→50℃45s→72℃1min]35个循环→72℃5min（后延伸）→4℃∞ 制备琼脂糖凝胶： 称取0.8g琼脂糖置于三角烧瓶中，加80mlTBE，放入微波炉加热至无晶体溶液→待冷却至60℃，加入0.5μL溴化乙锭EB，轻轻摇匀→导入预先洗净、干燥并且已经放入胶板，胶梳的胶池中（不能有气泡），冷却凝固30min。 上样： 两手垂直向上拔去胶梳，把凝固好的胶片推入电泳槽中，加适量的TBE使其掩盖胶片→在经PCR扩增的样品中加入1μL的溴酚蓝（Loading buffer）离心摇匀→用移液枪上样 电泳：设置电压110V，时间30min，以指示带不跑出凝胶为最长时间。 平板的制备： 加40μL 50mg/mL的X-gal和40μL 100mg/mL的IPTG，充分混合，在无菌条件下涂布于含AMP（50μg/mL）的LB平板上，将平板置于37℃恒温箱中2至3小时，使培养基充分吸收色素底物X-gal；在其盖子上划分A、B、C、D区，面积：ABCD。 提前半小时打开无菌操作台的紫外灯灭菌 查看电泳后的有两条斑的转化菌液样品，用酒精灯擦手将其菌液在无菌工作台上划线于含AMP和X-gal、IPTG的培养基上，正面朝上放30min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口胶封好培养基，倒置培养基，放入恒温箱中37℃15小时。 10、挑出白色单菌落，用21、22、131三个单条带的LB培养基中的白色单菌落去摇菌14h。 11、①取3mL的菌液，12000rpm离心2min收集菌体，倒掉培养液。②在菌体沉淀中加入SolutionⅠ250μL，震荡至彻底悬浮菌体。③在菌体沉淀中加入250μL SolutionⅡ，颠倒离心管5-10次混匀，静置4min。④加入350μL Solution Ⅲ，立即颠倒5-10次混匀。⑤12000rpm离心10min。⑥将上清液转移至吸附柱上，8000rpm离心30秒，倒掉液体，将吸附柱放入同一收集管里。⑦向吸附柱加入500μL Wash Solution，10000rpm离心1min，倒掉液体，将吸附柱放入同一个收集管中。⑧重复⑦一次。⑨将空吸附柱和收集管放入离心机，12000rpm离心2min。⑩将吸附柱放入干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入100μL Elution Buffer，静置2min，10000rpm离心1min，将得到质粒DNA。 12、用所提取到的质粒DNA，进行电泳。 四、实验结果与分析： 图2 四种菌液DNA的电泳结果 图6 提取的质粒的电泳结果 基因多态斑的读取及其遗传相似性的分析 1材料 图1 Test1