基因工程概论(8-9)解读.ppt

重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 B 高等哺乳动物的受体系统 C 高等哺乳动物的载体系统 D 高等哺乳动物的基因转移 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 D 高等哺乳动物的基因转移 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 B 离子交换层析 C 凝胶层析 D 亲和层析 E 膜分离 F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 D 亲和层析 重组DNA技术与基因工程的基本概念 9 外源基因表达产物的分离纯化 凝胶层析的基本原理 凝胶介质的基本性质 凝胶层析的基本操作 凝胶介质的选用原则 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合 物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之 外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们 下行速度快 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙 即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢 鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定 以及分离纯化。 凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G 150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温 葡聚糖凝胶（ Sephadex ） Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既 可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶 质的凝胶过滤 凝胶介质的基本性质 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）和Bio-Gel-A等 （Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排 阻限度。 琼脂糖凝胶 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大 分子物质（如蛋白质和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围 与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。 凝胶介质的基本性质 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联 而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交 联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种 聚丙烯酰胺凝胶 （ 数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度） 凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分 离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量 的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G- 组别分离 15、Bio-Gel P-2或P-4 凝胶介质的选用原则 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离 该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶 在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由 分级分离 于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 凝胶层析的基本操作 平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡 层析柱平衡 操作压控制 平衡和洗脱时应维持流速恒定 恒定的操作压是恒流的先决条件 凝胶层析的基本操作 上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定： 进样体积 进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10% 进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能 窄，这样洗脱出的峰形好 9 外源基因表达产物的分离纯化 亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析配基的性质与选择 亲和层析的基本操作 亲和层析的基本概念 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 亲和层析的基本特点 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离