2013年发酵工程实验讲义.docVIP

实验一 正交实验设计法优化酵母菌培养 一．实验目的： 掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二．实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。 三．仪器与试剂 1．仪器设备 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电磁炉。 2．试剂 葡萄糖，蔗糖，酵母膏，KH2PO4 四．实验方法 （1）培养基的配制(见表,2) 表1 正交表试验设计 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表2 正交表实验方案 葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三角瓶装入培养基100 ml，于121℃下灭菌30 min，冷却。 （3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。 （4）测0D值：将接种24 hr后时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表2 (5) 通过对正交实验所得数据进行分析,最终确定最佳培养基的组成。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的0D值，你将如何选择波长? 实验二　　淀粉酶的固态发酵实验 一．实验目的 了解和掌握微生物在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲线和测定方法。 二．基本原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a－1，4－葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水杨酸被还原为3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722型分光光度计540 nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量 三．培养基及试剂 1．培养基 培养基（250mL）：麸皮7g ，面粉0.5g，NaNO3 0.15g，营养盐6.5mL，pH自然。 营养盐配方（g/L）：KH2PO4 3.0；(NH4)2SO4 2.0；Cacl2 0.5；MgSO4.7H2O 0.5；Cocl2 0.003；FeSO4 .7H2O 0.0075；ZnSO4 0.002； pH5~6。 2．试剂 （1）DNS溶液的配制 酒石酸钾钠182g溶于500mL水中并加热，然后依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，2mol/L的NaOH 262mL，苯酚5mL亚硫酸钠5g搅拌溶解后定容至1000mL存于棕色瓶中，放置7-10天备用。 （2）考马斯亮兰G—250溶液 称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 （3）0.2M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）缓冲液 吸取12.3mL 0.2的Na2HPO4和87.7mL 0.3mol/L?NaH2PO4混合均匀即得pH6.0的Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液。 四．实验方法 1．淀粉酶活的测定 参照Bernfeld法。取适当稀释的粗酶液0.5mL加到0.5mL2%可溶性淀粉液中(pH6.0，0.2mol/L磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液配制)，于50℃水浴反应10min，用DNS法测定产生的还原糖。 CK 样品1 样品2 样品3 底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5 50℃水浴准确反应10min DNS（mL） 3 3 3 3 酶液（mL） 0.5 0 0 0 置于沸水中加热反应10min 蒸馏水 加蒸馏水至20. 5mL, 摇均后静置10min 550