分子生物学常用实验技术及方法.docVIP

第二章常用实验技术及方法 、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR) 反应总体积为50 μl，其中含有： 模板DNA μl PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 μl 10×MgCl2 溶液 5 μl dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 μl 引物1 (50 umol/L) 0.5 μl 引物2 (50 umol/L) 0.5 μl Taq DNA 聚合酶 0.5 μl 无菌去离子水加至 50 μl 上层用25 μl 液体石蜡覆盖。 循环参数： 94 ℃变性 min 94 ℃变性1 min 56 ℃退火1 min 72 ℃延伸2 min 共30个循取环 μl PCR扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。、基于PCR的定点突变 1根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但含有欲突变后的碱基序列；2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 扩增片段1，用基因3’端的Primer和Primer 一起扩增片段2，PCR反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可略有调整，反应完毕后，分别电泳回收片段1和片段2； 3以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 μl： 片段1 1 μl 片段2 1 μl 10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 μl 10×MgCl2溶液 μl dNTP (2.5 mmol/L) 5 μl Taq酶 1 μl 加ddH2O 50 μl 在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer ，按上述反应条件再扩增30个循环4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定。Total RNA的提取 (Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11) 1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的Catrimox-14TM溶液，然后充分混匀； 2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心： 细胞数5×105 ： 9500 rpm (约5 000×g) 5 min 细胞数5×105 - 1×107 ：3000 rpm (约450×g) 5 min 1×107 ： 1500 rpm (约112.5×g) 5 min 3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后， 12000 rpm离心2 min； 4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动； 5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液； 6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液； 7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次； 8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。 四、RT-PCR (TaKaRa One Step RNA PCR Kit) 1. 按Takara Kit 中所提供的标准步骤配制PCR 体系； 2. 按以下条件进行RT-PCR 反应 (1) 50 ℃ 30 min (2) 94 ℃ 2 min (3) 94 ℃ 1 min (4) 56 ℃ 1 min (5) 72 ℃ 2 min 3. 重复步骤(3)-(4)-(5)，共30个循环； 4. 反应结束后，取3-5 μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物冷冻保存。 五、DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳 50×TAE: 242 g Tris 碱 57.1 ml 冰乙酸 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) 1. 称取0. g agarose，置于250 ml 锥形瓶中，加入0 ml 1×TAE（含EB 0.5 ug/ml），加热使其全部溶解； 2封口、安放梳子； 3铺板； 4胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1×TAE，淹没胶面，拔去梳子； 5将DNA 样品与6×的上样缓冲液混合，加于加样孔中； 680-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观察或拍照。 、从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段Vitagene DNA 片段回收Kit1. 用一灭菌刀片割下含目的DNA 片段的