实时定量PCR技术要点.ppt

实时定量PCR技术 目录 实时定量 PCR介绍 荧光PCR实验设计 Quantitative Real-time PCR技术的应用 PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 实时定量 PCR 实时定量 PCR (Quantitative real-time PCR) 是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新技术。是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 基本原理 实时荧光定量 PCR 是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J 型，符合2 N 方程(其中 N 为 PCR 的循环次数)，但实际上扩增曲线为 S 型。 主要类型 Taqman 探针法 Taqman 探针法 SYBR Green 法 SYBR Green 法 熔解曲线 荧光PCR实验设计 实验操作注意事项 Real-time PCR引物设计原则 Taqman探针设计原则 反应体系优化 实时荧光定量检测系统 —— 实时荧光定量 PCR 仪 工作流程 无论是哪个型号，所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分： 每个循环结束后，定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号的增加。 最后，定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析。 数据分析 —— 常见参数 ? 基线(baseline)：一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线。 ? 荧光阈值(threshold)：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10′ SD cycle 3-15 。 影响Ct值的关键因素 评估实时定量PCR反应的效果 数据分析方法 Quantitative Real-time PCR技术的应用 1、基因表达的研究 2、基因突变及多态性研究 3、转基因研究 Thank You ! 在基因表达的研究中，常用的方法有 Northern 印迹，RT-PCR 定量法等，而 Quantitative Real-time PCR 比 Northern 印迹、RT-PCR 定量法要方便、快速、准确的多。Quantitative Real-time PCR能检测各种组织细胞中 基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控、监控 mRNA 表达模式、检测组织中少量存在的基因、跟踪细 胞群体中克隆、定量分析基因在不同组织中的转录水平 等。 扩增 DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主细胞 内的生长准备，即可在媒介中的生物分子纯化过程中直接测得，因此 Quantitative Real-time PCR 可用于检测特异突变基因。利用Quantitative Real-time PCR 和有关 的间接测序方法，可对已知 DNA 序列进行基因突变及多 态性的分析。如对已知 DNA 序列进行位置突变基因及序 列多态性的定位，扩增 DNA 限制性位点检测遗传变异 等。 * * 韩东洺 2015-07-08 ? 与传统PCR一样用同样的基本成分： 双链DNA，引物，dNTPs，PCR buffer，Taq酶等。 ? 与传统PCR一样，反应在温度模块里循环进行： 双链DNA模板变性 引物与模板碱基互补-退火 引物延伸 → 新的扩增片段 在 PCR 反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测 PCR 产物的量，并由此推断起始模板含量。 根据Quantitative real-time PCR的化学发光原理可以 分为2大类： 1、探针类 包括TaqMan探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加； 2、非探针类 其中包括如SYBR Green I或者特殊设计的引物 (如 LUX Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。 Taqman