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Applications of FISH 基因组结构研究; 染色体精细结构变异分析; 病毒感染分析; 人类产前诊断; 肿瘤遗传学; 基因组结构研究 染色体精细结构变异分析 Viral Infections Prenatal Diagnosis 以21号染色体的相应片段序列作探针,与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行原位杂交,可快速、准确进行诊断。 FISH技术新进展 随着FISH的广泛应用,FISH本身也得到长足进步。这主要表现在以下几个方面: 探针 由最初的每次杂交用一种探针发展为每次杂交用多种探针,即由单色荧光原位杂交发展为多色荧光原位杂交 标记物质 由单一的几种发展为现在的几十种 杂交步骤和过程 分别由20多步、15h缩减为不到10步、2h 荧光原位杂交的发展前景 FISH技术在遗传学研究中已经取得了不小的成绩,但是其深度与广度还不够,尤其与生产实践、经济效益的联系不够紧密。 随着标记手段、检测试剂、荧光观察等技术的发展,FISH 技术的应用范围在不断扩展,今后该技术在研究细胞核骨架与基因表达的关系,基因转录、重排、扩增,基因组结构与调控,哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域将会起到积极的作用。 最常用的探针标记法是缺口平移法,其原理是:首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ在探针DNA双链上造成缺口,然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’的外切酶活性,切去带有5’磷酸的核苷酸;同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性,使荧光素标记的互补核苷酸补入缺口,DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用,使缺口不断向3’的方向移动,同时DNA链上的核苷酸不断为荧光素标记的核苷酸所取代。 变性后的探针DNA或RNA与随机引物混合 随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合 DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3’-OH端开始合成互补DNA链 反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针 3.寡核苷酸探针 为人工合成的DNA片段,一般长约20-50个bp(碱基)。可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针;如不知核酸序列,可依据其蛋白产物的氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。DNA自动合成仪的出现使探针的合成十分方便。由于分子小,因此更容易渗透到细胞的目标区域;但也正由于分子小,限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目,并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。 探针制备 4.RNA探针 制备的技术路线为:将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质粒的多克隆位点,以内切酶在插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一部位消化重组质粒,使之成为线性DNA,在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下,以含目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。由于RNA探针为单链,杂交时不存在第二条链的竞争,所以其敏感性较经缺口平移标记的DNA探针要高。 RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定,但RNA探针容易被RNase降解。 探针制备 5.肽核苷酸(PNA)探针 PNA寡聚物是一类新分子,其结构与DNA相似。但在PNA中,没有核糖-磷酸基骨架,其骨架是不带电的肽链(聚酰胺)。与DNA相比,PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度,因此杂交时,受探针变性温度和溶液PH的影响较小,鉴于这些特点和优点,PNA有望取代DNA或RNA作为FISH的探针。但由于PNA探针只能通过化学方法进行合成,而且合成费用高,因此迄今所用的PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒和泛端粒探针。 探针制备 PNA与DNA杂交时也遵循碱基互补配对原则 探针设计与特异性 探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性,能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。 以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例:LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库,探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb-400Kb,保证了探针的高特异性和极强的荧光信号;荧光基团采用直接标记法标记,不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号,借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常;由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法,即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号,而无需抗原-抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度,同时直接的镜检
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