《生物制药》酶类药物1教程讲解.pptVIP

酶的制剂形式： 结晶： 固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥） 液体：低温（0-4℃，-20℃） 提高酶蛋白的浓度 加入稳定剂 固定化 保存： 通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到酶粉，低温下可较长时期保存。 也可将酶溶液制成25％甘油或50％甘油分别贮于—25℃或—50℃冰箱中保存。 注意：酶溶液浓度越低越易变性，因此切记不能保存酶的稀溶液。 酶的分离纯化工作中的注意事项 1. 防止酶蛋白变性 2. 防止辅因子丢失 3. 防止酶被蛋白 水解酶降解 采取的措施: 1.避免泡沫的生成 2.加入金属鏊合剂EDTA 3.加入巯基试剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等 4.加入蛋白酶抑制剂 衡量分离提纯方法优劣的指标: 总活力的回收 (表示提纯过程中酶的损失情况) . 比活力提高的倍数(表示提纯方法的有效程度) 。 总活力=活力单位数/ml酶液×总体积(m1) 比活力=活力单位数/mg蛋白(氮)=总活力单位数/总蛋白(氮)mg 纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 回收率(产率)=每次总活力/第一次总活力×100% 二、酶活性测定 （一）、酶活性 1. 酶活性或酶活力 (Enzyme activity)：在最适条件下(25?C,最适底物浓度和最适pH），酶催化一定化学反应的能力，以酶促反应速度表示。 酶活性单位表示方法： 酶活国际单位（IU)：在25?C最适条件下（最适pH，最适底物浓度），每分钟转化1μmol 底物为产物的酶量。IU = 1 μmol/min. Katal （简称Kat ）：在25?C最适条件下，每秒钟转化1mol 底物为产物的酶量。1Kat = 1mol/s. IU与Kat的换算 1IU＝16.67×10-9Kat 1Kat＝6×107IU 1Kat＝109 nKat 注意： 如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。 在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。 2. 酶的比活性（specific activity ）： 指每mg蛋白所含的酶活性单位或每kg蛋白中所含的Kat数。比活性是表示酶制剂纯度的一个指标，对同一酶来说，比活性愈大，表示酶的纯度愈高。 回收率=某纯化操作后的总活性/某纯化操作前的总活性 ［总活性=比活性×总体积（总重量）］ 比活性= 总活性单位 总蛋白mg数 = U(或IU) mg蛋白 （二）、测定酶活性的方法 初速度法：在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量。 平均速度法：在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间。 动态连续测定法：在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。 从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表 1.干燥法:干燥后菌体产生自溶 （1）空气干燥:适用于热稳定的酶 （2）真空干燥:适于细菌 （3）冷冻干燥:适用于较敏感的酶 2.机械法 （1）研磨法 （2）组织匀浆法 （3）超声波法 （4）高压匀浆法 3.酶法处理 (二) 酶的提取 1.水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。 许多酶再蒸馏水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。 2.有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。 丁醇具有以下特点：（1）亲脂性强，特别是亲磷脂的能力；（2)兼具亲水性，在0℃在水中的溶解度为10.5%；（3）在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。 3.表面活性剂法 (三) 酶制剂的工业提取法 1. 发酵液的预处理及过滤 絮凝剂 2. 酶液的脱色 0.1~1.5%活性炭 3. 盐析法 4. 有机溶剂法 5. 喷雾干燥直接制备粉末酶制剂 酶的分离提纯三个基本环节： 第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液； 第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来； 第三制剂，即将酶制成各种