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生物化学PCR技术 主讲人：检疫二班 邹新路 2014.10.21 PCR定义 Polymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应) PCR：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 PCR原理 技术原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR基本成分 模板DNA 特异性引物 Taq酶（从水生栖热菌 中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。） 脱氧核苷三磷酸（dNTP） 二价阳离子 一价阳离子。 缓冲液 标准的PCR过程 1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延 伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。 PCR反应特点 特异性强　 ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性 灵敏度高 简便、快速 对成本纯度要求低 PCR循环参数 1、预变性（Initial denaturation）． 　模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。 2、引物退火（Primer annealing） 退火温度一般需要凭实验（经验）决定。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 3、引物延伸 引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。 延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定。 PCR循环参数 4、循环中的变性步骤 循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性： 变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 5、循环数 大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸 在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 PCR应用 1、生命科学 a、人类基因组计划 b、后基因组计划 以研究基因功能为核心，大规模的结构基因组、蛋白质组以及药物基因组的研究计划。 c、物种的分类、进化及亲缘关系 可以进行物种进化的保守性分析及物种多态性分析、物种鉴定。 医药 a、疾病的诊断和治疗 遗传性疾病检测；癌基因的检测和诊断；利用基因治疗方法治疗肿瘤性疾病。 b、致病病原体的检测 （细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等） c、DNA指纹、个体识别 （DNA身份证）、亲子关系鉴别和法医物证 骨髓或脏器移植配型。 d、生物工程制药 e、转基因动物制药及疾病模型 3、卫生安全 a、食品微生物的检测 （肉毒唆菌等；乳酸菌的检测；水中细菌指标测定。） b、动、植物检疫　 （烈性传染病、沙门氏菌） 4、环境科学 a、环境生态研究 阐明生物作用和物质循环的机理和过程、自然环境中生物大分子的变化机理及其环境效应并找到判断沉积物有机物。 b、环境监测 检测外环境致病性细菌盒有害生物。 * * * * * * *