(SOP)时间分辨荧光免疫实验操作指南解析.docVIP

时间分辨荧光免疫分析 实验操作指南以及注意事项 第一节 时间分辨反应过程图 TRFIA的操作要点　　优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证检测结果准确可靠的必要条件。各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作1、样本的采取和保存　　血清EDTA和柠檬酸合铕，使测值降低。血清样本可按常规方法采集,溶血样品在2-8℃可以保存天，如果需要长期保存，请－20保存，避免反复冻融。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和不要把样本保存在室温室温放置48小时可能会导致结果不稳定。 2、试剂的准备　　按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。3、 加样　　在中一般有3次加样步，即加样本，加物，加。加样时应将所加物加在板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。　　加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加和时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！注意吸头是有差异的加样品时把样品按个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，！　　在中一般有两次抗原抗体反应，即加样本和后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，　　固相免疫测定抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么反应总是需要一定时间的孵育。　　孵育。　　5、洗涤　　洗涤在反应步骤，却也决定着实验的成败。就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。在TRFIA操作中，洗涤是最的关键技术，操作者应严格按要求。　　TRFIA洗涤方式自动洗，手工操作注意板的底部不要弄脏或划伤，不要用手摸板的底部。6、加增强液 TRFIA技术特点之一就是抗原抗体反应完毕，加增强液，使得荧光信号增强100万倍，检测灵敏度大大提高。　　 第二节 时间分辨试剂盒的组成包括： 包被反应板：一块，96孔。 铕标记抗抗体：一瓶，冻干品，用时每瓶以1ml去离子水溶解缓冲液 参考标准品：共六瓶。 增强液：一瓶，50ml。 浓缩洗液 25(：一瓶，50ml，使用前用去离子水作1:25稀释。 分析缓冲液：一瓶，50ml。 说明书：一份。 第三节 时间分辨操作基本步骤 双抗体夹心法(检测抗原)：一抗包被、封闭→加入检测样品→加入Eu3+标记的二抗→加入增强液→检测 例如：TRFIA法检测甲胎蛋白(AFP)实验方法 1.试剂的准备 1） 甲胎蛋白参考标准品：使用前一小时将每瓶甲胎蛋白参考标准品用1ml去离子水溶解。 洗涤液：将50ml浓缩洗液和1200ml去离子水混合，作为工作洗涤液。 铕标抗体工作液：使用前一小时将每瓶铕标记抗甲胎蛋白抗体用1ml去离子水溶解，用分析缓冲液以1:75倍稀释作为铕标抗体工作液。 2.将所需数量的包被反应条置室温平衡。 3.每孔加25(l甲胎蛋白参考标准品或样品。 选一支最接近25(l的加样器，因为参考标准品是实验最关键的第一步，所以加样量要求非常准确。 在吸参考标准品时枪要在液体内吹打4次，使枪头内的表面张力平衡，从而达到吸样时进一步减少误差。 将样品加入到反应孔中要注意枪要垂直轻轻靠在孔壁上打入样品，要保持一个样品一只枪头，这样可以避免加样污染和孔内包被物不受加样影响。 4.加200(l分析缓冲液，振动孵育1小时。 剪一张与加样条大小相似的封口膜平稳封上加板条，写上标记。 将样品板放入震荡器时注意，减速、平稳、轻巧、放入震荡器中。 5.用洗涤液冲洗4次。 a、洗板时要注意板一定要与洗板机的样品架吻合。 6.每孔加铕标抗体工作液200(l, 振动孵育1小时。 a、铕标是是实验最关键的第二个步骤，所以配铕标时一定要保证，比例准确、充分混匀、加样量准确。 7.用洗涤液冲洗6次。 a、洗板时要注意板一定要与洗板机的样品架吻合。 8.每孔加增强液200(l，振荡孵育5分钟。 a、增强液是实验最关键的第三个步骤，虽然增强液是一个不