westernblot实验方案.ppt

* 2. 电泳(Electrophoresis)  2.1 SDS凝胶配制 配制相应浓度的SDS分离胶，TEMED加入后迅速混匀制胶，沿壁迅速灌注分离胶溶液，留出积层胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖5mm水(或异丙醇）层于分离胶溶液上，约30-60min后分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合）。 ddH2O轻轻洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的凝胶，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。 覆盖层可保持胶面平整和防止空气进入，因为氧气扩散进入凝胶会抑制聚合反应。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 * 配制相应体积的积层胶液体，在已聚合分离胶上直接灌注积层胶液体，立即插入加样梳，并在空隙处补足积层液液体（小心避免混入气泡），室温静置30～60min至完全聚合，将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入Tris甘氨酸电泳缓冲液，至少要淹没加样孔。小心拔出加样梳，避免损坏加样孔，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除；若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。 凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。 * 2.2 样品处理 取20～50μg总蛋白量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的蛋白样品，按1：1体积比加入2?上样缓冲液，加相同蛋白量体积不同时以1?样品缓冲液配平上样体积后，于95～100℃加热5～15min使蛋白充分变性，保证蛋白质从空间结构变为一级结构。 2.3 上样与电泳 冰上冷却后，把将处理好的蛋白样品按照预定的顺序上样到SDS胶加样孔内中。注意的是加样孔有多时，可加入等体积的上样缓冲液，最后记得点上预染蛋白质分子量Marker。预染Marker便于在电泳过程中监测蛋白质分离，也可以在随后的转膜步骤中指示转移效率。 Marker也用1?样品缓冲液调整至与样品等体积。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。当溴酚蓝到达凝胶底部附近时即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 注意事项： 1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴； 2.电泳Buffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价； 3.Buffer一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动； 4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。 Western Blotting 汇报人：赵丽 Western blotting 中文名称为免疫印迹，其程序是对经处理的样本（血清、培养细胞和组织匀浆）先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS),以分离蛋白。然后将电泳后的分离开的蛋白转移至具有结合力的膜上。对印迹膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。最后对膜上的蛋白质进行检测。 Western blotting 实验简介 方法优点 SDS:高分辨力 固相免疫测定：高特异性、敏感性 1.方法简便 2.标本可长期保存 3.结果便于比较 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blotting 方法 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 一: 直接法 Western Blotting 方法 优点： 1. 免疫特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 4. 可选择不同的Marker 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化 二、间接法 基 本 流 程 蛋白的提取 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻 摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置