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Western blotting 实验 配胶 准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪（ 1 ml 200ul 20ul） Tips 30%Acrylamide 1M Tris-HCL 溶液（PH=8.8） ddH2O 10%APS TEMD 15ml离心管 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在通风处。注意，玻璃板下面铺一张干净的草纸，加速玻璃板干燥的速度。 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下： 10%的分离胶 8ml ddH2O 3.256ml 30%Acrylamide 2.67ml 1M Tris-HCL 溶液（PH=8.8） 2.03ml 10%APS 40.61ul TEMD 3.17ul 用1ml的移液枪吸取ddH2O 3.256ml,可分3次吸取。装入到标有分离胶的15ml的离心管中。 从4℃冰箱中取出30%Acrylamide，用1ml的移液枪吸取30%Acrylamide 2.67ml，可分两次吸取。转入到标有分离胶的15ml的离心管中。 用1ml的移液枪吸取1M Tris-HCL 溶液（PH=8.8）2.03ml，可分两次吸取。装入到标有分离胶的15ml的离心管中。 从4℃的冰箱中拿出10%APS和TEMD，分别加入40.61ul（200ul的移液枪）和3.17ul（20ul的移液枪）。 加好后，震荡。 3 灌分离胶 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。 室温放置0.5-1h左右至聚合完全。 4 配制浓缩胶 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝了。 倾倒掉胶上层的异丙醇，反复用ddH2O冲洗，后用吸水纸吸干。 10%的分离胶配合6%的浓缩胶使用。配制浓缩胶，配方如下： 6%的浓缩胶 4ml ddH2O 2.39ml 30%Acrylamide 0.544ml 1M Tris-HCL 溶液（PH=6.8） 1.02ml 10%APS 40.82ul TEMD 2.04ul 配胶方法同上，各种溶液加入到标有浓缩胶的15ml的离心管中，后震荡。 5灌浓缩胶 用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平，避免产生气泡。 6冰箱过夜 待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。 电泳 准备物品： 微量注射器（或配有微量加样Tips的移液枪）电泳槽 凝胶玻璃板 蛋白样品 蛋白MARK 碎冰 5ml注射器 1x电泳液 1 固定 用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。 向电泳槽中加入1x电泳液 拔掉梳子，注意动作轻柔。 用5ml注射器吸取电泳液，后冲洗每个上样孔。 2 上样 取含有提取好的蛋白的EP管，放在冰上融化，按照要求计算上样量。 然后，用微量注射器吸取蛋白加入到上样孔中。一般蛋白MARK的上样孔在两边。 3 电泳 上样结束后，盖上盖子，插上电源。调节电压为80v，待蛋白MARK进入分离胶后，电压改为120V。根据目的蛋白的分子量大小及蛋白MARK电泳的位置来决定电泳结束时间。 转膜 准备物品： 转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转膜液 （4℃预冷 注意加入甲醇） ddH2O 1 准备一个浅盘倒入转膜液来平衡凝胶以及湿润滤纸和海绵。 2 根据凝胶尺寸，来确定NC膜的大小。用尺子量取后，用剪刀剪开。 放入浅盘中浸湿。用镊子取走包被膜的两片蓝纸。 3 将夹子打开，使黑的一面保持水平，红的一面在上面。在黑色夹板上铺一张海绵垫，用玻璃来回擀一遍擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸，一手用玻璃试管擀走其中的气泡。 4 将凝胶从电泳槽中取出，用ddH2O冲洗。后用切胶板撬开小玻璃板，注意动作要轻，一般，玻璃板撬开后，拿开小玻璃板，凝胶与小玻璃板就会分离，否则，用ddH20冲洗一下，凝胶与小玻璃板就会分开。 5 除去小玻璃板后，用切胶板将浓缩胶去除，注意避免把浓缩胶刮破。同时在胶的右上角做个记号，小心剥下分离胶盖在滤纸上。用手调整使其能与滤纸对齐，轻轻用玻璃试管擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上一个海绵垫，擀几下就