家蚕30k蛋白lp7的分离纯化及功能初探本科毕业设计（论文）.docVIP

硕士学位论文 家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权　　 　 　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 摘 要 家蚕30K蛋白是在家蚕血液中大量表达的一类低分子量脂蛋白，也是桑蚕特有的一类蛋白质。该类蛋白由脂肪体合成，并分泌到血液中，它们是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一，也是家蚕胚胎发育的重要能源物质。30K蛋白成员众多，其氨基酸序列同源性较高，因此对这类蛋白进行分离纯化较为困难。目前，已经分离纯化出的30K蛋白只有4种。家蚕基因组框架图的完成为我们提供了大量的数据资源，利用这些数据预测到10个30K蛋白基因，这些基因所编码的氨基酸数目在246-271个之间，理论等电点在6.1-8.4之间，分子量在28-31kD之间，它们的氨基酸序列同源性都在60%以上。本研究通过分析各类30K蛋白的理论等电点和分子量，设计并开展了30K蛋白的纯化工作，获得了一种新的30K蛋白，在此基础上对该蛋白进行了相关的分析和研究，主要结果如下： 本研究首先参考了10个30K蛋白的理论分子量和等电点，设计了分离纯化的实验流程和实验条件。通过硫酸铵沉淀和三种层析分离技术（阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析），对家蚕血液蛋白质进行分离纯化，最终获得一种30K蛋白。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）检测，所获得的蛋白样品信号峰单一。同时，通过MALDI-TOF-MS获得该蛋白的肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)，利用GPMAW（General Protein/Mass Analysis for Windows）软件搜索家蚕蛋白质理论数据库，该蛋白被鉴定为30K蛋白基因Bmlp7编码的蛋白LP7，且其序列与已报道的所有30K蛋白序列均有较大差异。 利用多克隆抗体制备技术，将分离纯化获得的30K蛋白LP7作为抗原，采取多次皮下注射的方法对家兔进行免疫，颈动脉放血法采集血液，获得其抗血清。通过饱和硫酸铵沉淀法粗提抗血清中的抗体，去掉了大量杂质和部分杂蛋白，最后获得了抗30K蛋白LP7的抗体粗品，达到下一步实验的要求。 通过Western blot技术，分别对家蚕5龄起、5龄第3天和羽化第3天的各个组织器官进行检测。结果发现，5龄起时，只在血液中检测到LP7；5龄3天时，血液中的LP7杂交信号强度明显增加，此外，在头、脂肪体和生殖腺中均检测到LP7，体壁和中肠中也有少量LP7存在，而丝腺和马氏管中没有检测到任何杂交信号。同时，分析家蚕5龄3天组织芯片数据，结果表明Bmlp7基因在头、脂肪体、体壁和生殖腺中表达，其中头的表达量最高，在丝腺和马氏管中只有微量表达，而在中肠和血液中没有表达。因此，我们推测5龄第3天血液中增加的LP7蛋白是由脂肪体中合成后转移而来的；中肠的微量LP7可能从血液中转移而来；丝腺和马氏管中Bmlp7基因的表达量较低，导致蛋白水平上检测不到。对羽化第3天的组织器官进行检测，发现所有组织中均存在LP7，但此时该蛋白在雌性生殖腺中的信号强度远远高于其他组织。LP7蛋白在家蚕大量组织器官中的广泛存在，暗示该蛋白在家蚕的生长发育过程中起着非常重要的作用。 同时，利用Western blot技术对家蚕部分时期的血液与生殖腺进行对比分析。发现在血液中，从5龄第3天开始检测到明显LP7杂交信号，并且随着生长发育的进行其强度逐渐增加，到化蛹第1天达到最大值，而后逐渐降低，羽化第3天时杂交信号已非常微弱；而在生殖腺中，5龄第3天的LP7杂交信号非常微弱，而后逐渐增加，蛾期达到最大值。这一结果表明生殖腺中的LP7蛋白可能是由血液中转移而来，并参与了