PCR引物的设计与实验操作技巧.pptVIP

非特异性扩增带出现的对策（三） 嵌套式和半嵌套式PCR对于减少或消除不需要的产物同时提高灵敏度经常是很成功的。首先在常规条件下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增，假象产物经常会与引物中的一条或两条配对，但其内部却是无关序列。接着对一部分反应物－产物混合物进行新一轮扩增，采用的引物与第一对引物内侧的序列配对，在这一轮扩增中只有真正的产物被扩增。这种办法即使在目的产物开始用EB染色检测不到而且有假象带时也常常获得成功。半嵌套式PCR，只第二条引物在目的片段一端的内侧，也同样有效。在基因步行或企图进行5‘或3’端RACE时，由于只有一条引物内部的序列是已知的，经常需要作这种变动。 采用嵌套式PCR方法，第一、二轮扩增在第20个循环左右终止而不是象通常的在第30－35个循环终止会获得更好的结果，这样做减少了产生不需要的高分子量带和成片产物的机会。嵌套式PCR极端敏感，在106基因组DNA背景中一个拷贝的病毒基因也能检测到。 * 出现片状拖带或涂抹带  　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；增加模板量，减少循环次数。  * 进行多轮PCR时，PCR产物成片的原因? 进行多轮PCR时，如果下一轮PCR反应的起始模板量太大，即使PCR条件是正常的，产物成片现象也可能会出现。总的规则是如果上一轮PCR产物在凝胶上见得到条带，只能用1??l上一轮PCR产物的1：104到1：105稀释物作为模板进行下一轮PCR。 另外对上一轮PCR产物稀释也降低了下一轮PCR产物出错的概率。 * 很少或没有检测到产物的原因 如果已经调整了Mg2＋浓度、缓冲液的pH值和循环产物，而且也增加了循环数，尝试过了较低的退化温度和TD PCR，但在EB染色的凝胶上还是看不到产物（聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶要敏感一些），而阳性对照表明试剂没有问题，下一步该怎么办？延长起始的变性时间和（或）提高温度能增加模板DNA完全变性的可能，以提供最大数量的引物配对位点。这一可选步骤的标准条件是95?C变性5分钟，有可能扩增发生了，只是效率不高，如果这样，可通过对干凝胶或印迹的杂交来检测产物。用同一套引物或者最好用嵌套式引物进行第二次扩增，有可能得到特异产物，这时必须用第一次PCR产物的从1：100到1：10000的一系列10倍稀释物。 很少或没有产物可能提示DNA样品中存在抑制物。许多PCR的抑制物已被描述过，它们包括离子性去污剂（如SDS）、酚、肝素等。通过把原PCR混合物与已知阳性对照模板（被证明可以扩增）的稀释物混合的方法可以验证制备的模板中是否有抑制物。若有，重新抽提、乙醇沉淀和（或）离心超滤有可能解决问题。纯化模板过程中残留的蛋白酶K可能会降解Taq DNA聚合酶，但它在95 ?C保温5分钟很容易变性。 * * 微生物基因工程 李刚 副教授 * 教学内容 一、PCR引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中 的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略； 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。 * 一、PCR引物的设计与实验操作技巧 聚合酶链式反应、分子克隆及DNA序列分析这三大类实验方法几乎构成了现代分子生物学的实验工作的基础。而三者中，PCR方法在理论上出现最早，在实践中应用得最广泛。 * PCR反应的七种基本成份 热稳定DNA聚合酶。 一对特异的引导DNA合成的寡核苷酸引物。 dNTP（混合液：标准PCR反应包含4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。 二价阳离子。所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，通常是Mg2+用于激活。 一价阳离子。标准PCR缓冲液内包含有 50 mmol/L的KCl，它对于扩增大于500 bp的DNA片段是有益的，提高KCl浓度在约70－100mmol/L范围内对改善扩增较短的DNA片段产物是有利的。 模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研单链或双链形式加入PCR混合液中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但当使用高分子量的DNA（10kb）作模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割其中的靶序列），则扩增效果更好。 * * PCR引物设计的几条原则： ① 引物长度 一般引物长度为18-30碱基就足够了。特殊情况下（比如Tm值或GC含量不合适）可以进一步延长到50-60 bp长度。但超过60bp的引物长度比较少见。原因一是超