金雀异黄素的抗肿瘤及与辐照联合效应作用机制的研究.pdf

2 3 金雀异黄素的抗肿瘤及与辐照联合效应作用机制的研究 中文摘要 中文摘要 研究背景： 大豆异黄酮是富含于大豆中的植物雌激素，其中金雀异黄素 （Genistein ）生物 活性最强。体内外研究均证实大豆异黄酮能减少激素依赖性肿瘤乳腺癌和前列腺 癌发病率，是一种很有前景的防治癌症的天然化学物质。已知激素替代疗法有助 于降低绝经女性结肠癌的发病风险，因此开展对植物雌激素的大豆异黄酮在结肠 癌中的防治作用的研究具有重要的意义。另外，作为肿瘤的放射治疗在临床上可 联合应用手术、化学或激素治疗，为了提高局部控制以及生存期，放疗联合放射 增敏试剂是一种针对癌症的有效的治疗方法，大豆异黄酮在其中所起的作用也值 得关注。 目 的： 研究大豆异黄酮对结肠癌和乳腺癌的抗癌作用及大豆异黄酮对结肠癌和乳腺 癌的辐射增敏作用。 方 法： 细胞株选用人结肠癌细胞 HCT-116 和乳腺癌细胞 MDA-MB-468 ，细胞于 DMEM 培养基中常规培养传代。除非特别交代，金雀异黄素的实验浓度定为 0、 25 、50 和100 μmol/L 。 采用MTT 法测定细胞存活率、流式细胞术分析细胞周期的分布、Western blot 法测定相关蛋白的表达、磷脂酰丝氨酸外翻法（Annexin V-PI 双染法）分析金雀异 黄素对细胞凋亡的影响；细胞内ROS 的影响（DCF 法）和线粒体膜电位的变化（JC-1 法）采用试剂盒检测；采用透射电镜下观察细胞超微结构的改变；金雀异黄素对 肿瘤细胞的侵袭转移的影响，采用Transwell 实验、细胞粘附性实验以及免疫荧光 法测定E-钙粘附蛋白（E-cadherin ）和基质金属蛋白酶（MMP2 ）的变化进行研究。 金雀异黄素对肿瘤细胞放射敏感性的初步研究选用无毒性 25 μmol/L 的金雀 异黄素处理细胞，联合X 射线对细胞进行辐照。采用克隆形成实验计算细胞存活 I 中文摘要 金雀异黄素的抗肿瘤及与辐照联合效应作用机制的研究 分数、流式细胞术检测细胞周期和细胞的凋亡、并用Western blot 法进一步检测金 雀异黄素预处理对照射后细胞内DNA 损伤修复相关蛋白表达的调节作用。 结 果： 1. 结肠癌HCT-116 (1) 金雀异黄素对 HCT-116 细胞增殖有明显的抑制作用，并呈浓度和时间依 赖关系，抑制50%细胞生长的剂量（IC50 ）为123.8μmol/L （24 h ）。0、25 、50 和 100 μmol/L 金雀异黄素处理后出现了明显的G2/M 的周期阻滞，细胞数量从18.11 ±1.36%增至 32.7 ±0.04% 。进一步的机制研究发现，金雀异黄素处理降低了细胞 周期蛋白CyclinB1、CyclinH 表达，对CylinD3、CyclinA、CyclinE 的表达无明显 影响。 (2) 金雀异黄素处理HCT-116 细胞后，Annexin V/PI 双染法结果显示早期凋亡 细胞比例随浓度增加而上升，晚期凋亡细胞也略有增多。特征性的Sub-G1 凋亡峰 随处理浓度的增加而增多。100μmol/L 金雀异黄素处理2 h 后细胞内ROS 水平达峰 值，为处理前的1.81 倍（15.53±1.55% vs 8.57±0.35% ），然后逐渐下降。100μmol/L 金雀异黄素处理 1h 后线粒体膜电位迅速下降了87.8%，以后虽略有回升，但维持 在极低的水平。与凋亡相关的P53 蛋白出现升高，并且抑凋亡蛋白Bcl-2 出现了下 调，促凋亡蛋白 Bax 出现了上调。透射电镜下，金雀异黄素处理后细胞呈现不同 程度的凋亡和自噬性改变。 (3) 100μmol/L 金雀异黄素处理 8h 后细胞粘附性为 81.32 ±3.26%，对照组为 97.31 ±7.68% ，即金雀异黄素显著降低粘附能力。Transwell