血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定解析.pptVIP

教学内容： 一、血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 二、设计性实验的布置 三、下次实验讨论内容安排 综合性实验：实验四 ——血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 P.36 实验目的： 一、γ-球蛋白的分离 采用中性盐使混合物中不同蛋白质析出沉淀下来的分离方法。 一、γ-球蛋白的分离 一、γ-球蛋白的分离 按泳动快慢顺序分为：清蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白。 思考题 ： 二、设计性实验的布置P.121（实验二十五）  影响酶促反应速度的因素： * 硫酸铵是蛋白质盐析常用的中性盐，在0～30℃范围内溶解度变化不大；25℃时饱和溶解度为4.1 mol/l，0℃时饱和溶解度为3.9 mol/l。在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来。而且硫酸铵价廉易得，分段盐析效果好，不容易引起蛋白质变性。 影响因素：①温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。②pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。③蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。 离心技术 层析技术 电泳技术 1.进一步掌握生化四大基本实验技术的基本原理及应用； 2.了解组织蛋白的提取及鉴定原理。 【基 本 原 理】 血清蛋白 球蛋白 清蛋白/白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 57%～72% 2%～5% 4%～9% 6.5%～12% 2%～20% pI=4.9 pI6 pI=7.3 ——分段盐析法（离心技术） 盐析法（salting out/salt precipitation） ： 改变中性盐的浓度/pH可使不同的蛋白质分批分次沉淀下来的过程。 常用的中性盐有：硫酸铵 分段盐析法： 血清蛋白 球蛋白 白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 [饱和(NH４)２SO４] [半饱和(NH４)２SO４] [33%(NH４)２SO４] ——分段盐析法 二、γ-球蛋白的纯化(除盐) ——凝胶层析技术 （NH４+） 凝胶层析法（脱盐） 凝胶过滤层析过程示意图 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶珠 血清蛋白 球蛋白 白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 [饱和(NH４)２SO４] [半饱和(NH４)２SO４] [33%(NH４)２SO４] ——分段盐析法 二、γ-球蛋白的纯化 ——凝胶层析技术(除盐) 三、γ－球蛋白纯度鉴定 ——电泳技术 血清 层析获得的γ－球蛋白 ? ? ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 加样线 加样线 纯化蛋白 对照 样品 （一）γ-球蛋白的分离(分段盐析法）： 血清1ml +PBS 1ml 混匀 逐滴加入pH7.2 饱和硫酸铵液2.0ml 边加边摇匀 静置5min 离心（3000rpm,10’） 尽量倒尽 PBS 1ml 逐滴加入 饱和硫酸铵液0.5ml 上清液（α、β球蛋白） 倾去 沉淀(γ球蛋白) PBS 1ml溶解 实验操作及注意事项 沉淀 (球蛋白) 上清液 （清蛋白） 混匀，静置5min 离心（3000rpm,10’） （NH４+） （二）γ-球蛋白的纯化（凝胶层析除盐）： 检验 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶珠 白色比色盘 黑色比色盘 （纳氏试剂） （10%三氯醋酸） 黄色 （NH４+） 白色沉淀 （蛋白质） +++ ++ + - - - - - - - 铵离子 - - + ++ +++ ++ + - - - 蛋白沉淀 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 管号 铵离子 蛋白沉淀 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 管号 血清 （点1次） 6管的γ－球蛋白（点2~3次） （三）γ-球蛋白的鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）： 电泳：150V，45min； 染色：氨基黑10B染色1min； 漂洗：先自来水冲洗，漂洗液反复浸洗2~3次； - + ? ? ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 加样线 加样线 纯化蛋白 对照 样品 1．除了用凝胶过滤方法除去样品中盐外，还可以用哪些方法除盐？ 2．如何对分离、纯化后所得到的γ-球蛋白的纯度和含量进行鉴定？ 底物浓度 酶浓度 温度 pH 抑制剂 激活剂 （一、温度对唾液淀粉酶活性的影响）（前4号/每组） （三、琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制）（后4号/每组） * 硫酸铵是蛋白质盐析常用的中性盐，在0～30℃范围内溶解度变化不大；25℃时饱和