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固定长度的目的片段使用Primer5设计引物的过程
固定长度的目的片段使用Primer 5 设计引物的过程
打开软件
复制基因序列
粘贴
选项AS is- OK
点击primer 按钮，弹出菜单后点击search按钮
选择 PCR primer，Sense primer 位置、长度参数，并选择所需PCR产物长度，OK
弹出如下界面
然后继续search 设置anti-sense primer的位置、长度及PCR产物的长度等参数
通过search 来不断调整sense primer及anti-sense primer的位置及长度，直至调整到可以扩出目的片段全长或近似全长。
进而编辑sense primer及anti-sense primer，适当删减或增加碱基，避开结尾TTT或AAA，尽量以G结尾，使得TM相近、GC含量适当（45-55%之间）。
点击Anti-primer 和edit之后，弹出界面：
在最后添加碱基T并分析analyze:
此时引物3’端为A，不稳定，删除3’端的A，使之从5’-3’为以G结尾，analyze，OK，为：
此时，引物设计基本完毕sense primer为：
Anti-sense primer为：
因为我们要扩增的片段既定的目的片段，所以只考虑所设计引物的长度（与合成准确率有关，长于25bp的引物合成准确率降低）TM（PCR时两端引物退火温度应尽量一致）及GC含量，忽略其形成引物二聚体、发卡结构等。所以虽此次设计的sense primer与anti-sense primer都有飘红现象，忽略之。
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