纤维素菌分离.ppt

实验一 纤维素降解菌的分离和筛选 1.实验目的实验目的： 1.1.掌握纤维素降解菌的的分离和筛选 1.2.学会会培养基的制备方法 1.3. 了解菌落的形态 2.实验原理： 野外的纤维素降解菌通过加水饥饿后梯度稀释，接种到纤维素降解菌专用培养基上生长成纤维素降解菌单菌落，根据菌落特征从而达到分离和筛选纤维素降解菌的目的 ( 从学院树林中取适量的林下腐殖土壤、腐朽木、用无菌水将得到的样品经适当稀释, 在28℃下培养1d，稀释10-6、10-7、10-8 三个浓度，分别接种于鉴别培养基中培养, 每组3个平行，在37℃下培养2-3 d，然后进行初筛，重复以上步骤，直至获得纯的菌株。最后镜检。) 3.仪器设备 4.药品 (NH4)2SO4 MgSO4 KH2PO4 明矾 纤维素钠 刚果红 琼脂 蒸馏水 5. 试验方法试验方法试验方法试验方法： 5.1. 取样： 先从树林中取10g土壤(10—15cm深)。用灭菌的塑料袋盛装。 5. 2.饥饿培养 ：秤取10g土壤，置于250ml的装有90ml无菌水的锥形瓶中，摇匀，在37℃下培养1d。 5.3. 梯度稀释 所需仪器：试管（8支）、洗耳球、移液管。 需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、移液管。 用移液管从饥饿培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。然后用移液管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3, 10-4,10-5,10-6,10-7,10-8不同稀释度的土壤溶液。 5.4.选择培养 5.4.1刚果红培养基的制备 所需要的仪器有：500ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、称量纸等。 (NH4)2SO4 2g MgSO4 0.25g KH2PO4 1g 明矾 2g 纤维素钠 1.88g 刚果红 2g 琼脂 18g 蒸馏水 1000ml 按上表比例配制150ml选择培养基。在500ml锥形瓶中装入150ml培养基，用2层纱布加棉花做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层报纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。灭菌后，倒9个灭菌平板，凝固后待用。 5.4.2.涂布平板： 将上述已倒培养基的9个平板底面分别用记号笔写上10-6、10-7、10-8 3种稀释度（每个稀释度划3个平板）。然后用移液管分别由10-6、10-7、10-8三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。38℃倒置培养2-3d，至菌落长出，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。 6.菌落形态观察 6.1.划线分离 PDA培养基的制备方法 马铃薯 200g 纤维素（cmc）若干克 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml 马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后纱布过滤，再加琼脂，融化后不足水至1000ml。121℃灭菌30min. 按以上比例配置50ml培养基，分别倒入3个灭菌的平板当中，待凝固后，从以上涂布的9个平板当中取出1个菌落周围的透明圈比较大的平板。用接种环挑取菌落在平板培养基上进行梯度划线。连续做3个平行，置于38℃下培养。 重复以上步骤,进行连续3次纯化培养。直至获得纯的菌株。 6.2.斜面培养 选取透明圈大且降解能力强的菌株以待划线时使用。 如上面制备PDA培养基，将其倒入1支灭菌试管里，每管约倒入1/3的培养基，倾斜置放，30min之后，带其凝固，用接菌环挑去少量菌落划线培养，做3个平行。置于38℃下，培养2-3d。直至长出菌落。 5.镜检 所需仪器或试剂：菌种的平板培养物、番红、显微镜、酒精灯、载玻片、接种针、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、蒸馏水等。 操作步骤： 制作（挑取、印染）---染色（番红）---静置10min---冲洗（蒸馏水）---加片（盖玻片）---镜检 结果：从形态和印片染色看，该菌属于放线菌。 全班分为 灭菌组；显微观察组；培养基配制组；纤维素降解菌的分离和筛选组，分工合作，资源共享。 思考题 1.如何进行微生物纯化？ 2.分离纤维素分解菌前，为什麽采用饥饿培养法 培养纤维素分解菌？ 3.明矾在刚果红培养基中的作用？ 4.刚果红在观察放线菌落圈时有何作用？ * * 500ml锥形瓶 天电子天平 药匙 拨棒 试管 称量纸 移液管 摇床 洗耳球 培养皿 电路 涂布棒 刚果红平板 放线菌 *