免疫磁珠分离结合荧光微球免疫层析方法的建立及其在大肠杆菌O157%3aH7检测中的应用.pdfVIP

摘要 IIIIHI lIIIIIIIIIIIMIIIIHIIM 摘要 大肠杆菌0157：H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)中最具代表性的血清型， 能引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症或血栓形成性血小板减少性紫癜 等疾病，该菌已在世界范围内引起感染流行。因此，探索建立能适用于现场或基 层的灵敏度高、特异性强的检测方法，对于该菌的防控具有重要意义。免疫层析 方法以其检测快速、操作简便、灵敏度高等特点成为该菌筛查中的常用方法。 标记物的选取在免疫层析技术中至关重要，目前，胶体金的应用最为广泛。 本研究在大量的前期工作基础上，比较了纳米荧光微球和胶体金作为标记物偶联 抗大肠杆菌0157：H7单克隆抗体的偶联率，制备了基于双抗体夹心原理的荧光 物的偶联规律对免疫层析方法的影响进行了深入细致的比对研究。单抗与荧光微 球的偶联率随着抗体投入量的增加而降低，但是偶联到微球表面的抗体量却不断 增加，当抗体与荧光微球的比例达到100 I．tg／mg时，层析方法的灵敏度不会再随 抗体标记量增加而提高；单抗与胶体金的偶联率并未随抗体投入量的增加呈现规 律性变化，当抗体与胶体金的比例达到10 I-tg／mL时，增加抗体的投入量也不会 CFU／mL，要 提高试纸条灵敏度。最终结果显示，FM．ICTS的灵敏度为9．6x103 CG-ICTS消耗的单抗量为0．4 I．tg，所以在该检测体系中，从检测灵敏度和抗体使 用量角度比较，荧光微球更具优势。当菌液浓度高于106CFU／mL后，检测线(T 线)出现信号降低的趋势，出现免疫层析中较少报道的HOOK效应，印证了层 免疫磁性分离技术(IMS)已广泛应用于致病菌的分离中，本研究IMS与 FM．ICTS相结合，成功的应用于生牛乳中大肠杆菌0157：H7的检测。1mL纯培 能明显缩短60rain预增菌时间。接种量为0．5、2 CFU／g的生牛乳，选择性增菌 h才能检出阳性信号，而用免疫 后用FM-ICTS检测，分别至少需要培养11、9 磁分离结合FM-ICTS的方法只需9、7h即可检测阳性信号，IMS能消除生牛乳 增菌肉汤基质的影响，提高检测灵敏性。 关键词：大肠杆菌0157：H7；荧光微球；胶体金；免疫层析技术；免疫磁分离技 术。 ABSTRACT ABSTRACT Escherichiacoli0157：H7iSa strainthatcouldcause typicalenterohemorrhagic uremic or thrombotic diarrhea,hemorrhagiccolitis，hemolyticsyndrome 0157：H7hascausedoutbreaksofdiarrheaand coli thrombocytopenicpurpura．E is to on-sitedetection associateddiseasesworldwide．Therefore，it im