大学学位论文o型、asia 1型fmdv衣壳蛋白嵌合体在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性的分析.docVIP

摘要 FMDV属于小核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）病毒科(picornaviridae)，口蹄疫病毒属(aphthovirus)，口蹄疫病毒能够使大部分偶蹄动物感染、发病，并且能够在大范围内快速传播的烈性传染病，是世界范围内影响经济发展的重要动物疾病。FMDV的基因组为一条由60个重复呈20面体的衣壳蛋白包裹的单股正链RNA，全长约8500nt，衣壳蛋白由结构基因VP1，VP2，VP3，和VP4组成。暴露在衣壳表面的蛋白对病毒的抗原性起到决定作用。Bac-to-Bac BmNPV的宿主只有家蚕，在室内饲养，进化了几千年。与其它的有脊椎动物的病毒相比BmNPV是安全的。在多角体中增加外源蛋白的比例，找到的用多角体蛋白表达外源蛋白。 使用特异性引物通过融合PCR（Fusion PCR）扩增同时含有Asia1型和O型编码衣壳蛋白区域的基因。然后将鉴定正确的基因克隆至供体质粒pFastBacDual。将酶切和测序鉴定正确的重组质粒pFastBacDual转化至大肠杆菌DH10BAC感受态细胞进行蓝白斑筛选。使用cellfectinⅡreagent转染试剂，将PCR鉴定正确的重组杆粒转染Sf9细胞。用重组杆状病毒感染Sf9细胞的方法扩增病毒，用扩增的病毒感染细胞，在感染72h后收获细胞，表达的目的蛋白经Western blotting检测、双抗体夹心ELISA检测。 Western blotting检测结果表明重组的嵌合体P12A3C基因在昆虫细胞中获得表达，且能被VP1单克隆抗体和口蹄疫多抗识别，特异性条带的相对分子质量约28k，与VP1大小一致。双抗体夹心ELISA检测结果表明表达的目的蛋白同灭活的口蹄疫抗原有相似的抗原性；根据测定的TCID50对细胞进行定量的感染，使目的蛋白定量的表达，通过Western blotting检测、蔗糖密度梯度离心并对纯化的样品做电镜观察分析，证明嵌合体基因不影响蛋白的表达和空衣壳的组装，但是会在一定程度上影响蛋白的表达量。蔗糖密度梯度离心加入等量佐剂乳化后免疫BLAB/C小鼠，液相阻断ELISA检测结果表明BLAB/C小鼠免疫后28d能检测到了FMDV抗体。本研究为空衣壳的体外组装及提高口蹄疫空衣壳结构蛋白体外的表达量奠定了基础。 关键词：口蹄疫病毒昆虫杆状病毒表达系统空衣壳；免疫原性 Expression the capsid protein of FMDV Asia type 1 and O type Chimera using the Baculovirus Expression Vector Systems and Detecting of Its Immunogenicity summary Foot-and-mouth disease virus(FMDV),the prototype member of the Aphthovirus genus within the family Picornaviridae,is a highly contagious agent infecting cloven-hoofed animals(including cattle,pigs,sheep,and goats),and it causes one of the most economically important animal diseases worldwide.Each FMDV particle contains a single-stranded positive-sense RNA genome (ca.8.400 nucleotides) enclosed by an icosahedral protein shell (capsid) consisting of 60 copies of each of thefourstructuralproteinsVP1,VP2,VP3,andVP4.The surface-exposed FMDV capsid proteins (all but VP4,which is entirely internal) play a key role in the antigenic properties of the virus(e.g.defining the serotype). Bac-to-Bac expression system, which is an efficient system to construct recombinant baculovirus and express foreign protein at a high level. The host of BmNPV is only l