5.植物外源基因转化方法及转化子的检测教案分析.ppt

第五讲 植物外源基因导入方法及转化子的检测 1.概述 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类所需要的新品种或新物种。 外源DNA通过载体介导实现其转化的系统称之为基因载体转化系统。 2.植物基因转化的受体 原生质体 悬浮细胞 胚性愈伤组织 胚状体 叶片切块 其它受体：如花、子房、离体条件下的子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花粉等 3.植物转基因的方法 外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法 病毒介导法 外源基因的直接转化法 化学诱导DNA直接转化 物理法诱导DNA直接转化 花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法） 3.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。 它是利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti (Tumer induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。 迄今所获得的近200种转基因植株中80％以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。 根癌农杆菌（Ti质粒） 植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用 土壤农杆菌的毒性区基因被激活 T-DNA的切割和T复合物生成 T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进入植物细胞 T-DNA整合到植物染色体上 挑单克隆 收集细胞 用液体MS培养基重悬细胞 将预培养的外植体放入菌液中侵染 取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液 共培养 在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽 诱导芽生长 生根，形成转化植株 3.2病毒介导法 病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体“植物病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正在研究发展的植物病毒载体系统有3种: 单链RNA植物病毒载体系统,是以单链RNA为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA,将其克隆到质粒或粘粒载体上,把外源基因插入到病毒的cDNA部分,通过体外转录,将带有外源基因的病毒DNA感染并进入植物寄主细胞。 单链DNA植物病毒载体系统,是由单链环状DNA分子组成,一般存在成对的2个病毒颗粒，这种二连基因组可以把外源基因插入其中1种DNA上而不影响另1种DNA基因组的复制。 双链DNA植物病毒载体系统,是将其病毒基因组中对病毒繁殖非必需的1段核苷酸序列去掉,换上1小段外源DNA而不影响病毒基因组正常包装”用这样重组的病毒载体感染植物细胞以获得外源基因的转移。 病毒载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。 但是病毒载体的容量有限,不能包装大片段的外源DNA基因组,寄主范围窄,复制稳定性差,转录和复制机理复杂。 目前,用的较多的是花椰菜花斑病病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。此法需要注意的是其他病毒侵染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换,进而导致载体病毒重新获得其致病能力”因此,其潜在的危害性必须予以足够的重视。 3.3 DNA直接导入基因转化 所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的裸露的DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的技术。常用的DNA直接转化技术根据其原理可分为化学法和物理法两大类。 3.3.1化学诱导DNA直接转化 化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法。目前主要有2种方法：PEG介导法和脂质体介导法。 PEG介导基因转化 脂质体介导基因转化 PEG介导基因转化 PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。 PEG通过电荷之间的相互作用,与DNA形成紧密复合物,植物细胞通过内吞作用吸收这些复合物，一般PEG浓度较低时,不会对原生质体造成伤害,而获得的转基因植株。 来自同1个细胞,避免了产生嵌合转化体,转化稳定性和重复性好,容易选择转化体，受体植物不受种类的限制。 但对原生质体培养和再生困难的植物难以利用,且转化率低,一般在10-5~10-6。 这种方法首先用在模式