土壤中分解尿素的细菌的分离与计数lotus.ppt

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一、课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2 ) 2 + H2O CO2 + NH3 脲酶 3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一.研究思路 ㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照 1、实例： 2、自然界目的菌株帅选的原理： 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法： ⑴ 抑制大多数微生物不能生长 ⑵ 造成有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 3、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4`7H2O 2.1g NaH2PO4 1.4g KH2PO4 4、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 ② 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ㈡ 统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点: 2.活菌计数法（间接计数法） ⑴ 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培 养基上所形成的一个菌落是由一个单 细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原 先的一个单细胞。 ⑵ 常用方法：稀释涂布平板法。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 注意事项 ① 为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30——300的平板上进行计数。 ② 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算 出菌落平均数。 ③ 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 ④ 涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以 三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平 均菌落数在50个左右为最好。 设置对照的主要目的: 是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 ㈢.设置对照： 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。 原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 二.实验的具体操作 ㈠.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆ 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。 ㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 ◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、 适于