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第七章 层析 一、 学习目的与要求 　　了解层析原理，掌握各种常用层析方法的操作与应用。 二、 学习指南 　　 （一） 层析原理与分类（重点） 　　识记：层析方法分类 　　理解：层析原理 　　（二） 层析过程理论基础（一般） 　　理解：层析理论的三种模型 　　（三） 分离度（重点） 　　识记：分离度的概念 　　理解：如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分离程度 第一节 层析的理论基础 1.1 层析原理 定义：根据混合物中，溶质在固定相和流动相之间不同的分配比例，引起移动速度的不同而进行分离的方法。 层析必须具有三部分，固定相、流动相、待分离的样品。 典型的柱层析分离设备示于图: 原理：利用各种物质在柱内停留时间的长短不一，流出有先有后，因而得到分离。 操作示例：分别用小圆圈、小方块和小三角来代表三种物质。它们基本上在同一时间内流入柱内，但因三种物质在柱内停留的时间不同，离开柱有先后。其中小三角停留时间最短，它率先离开层析柱；小圆圈最缓慢，它在柱内停留时间最长。其结果是小三角物质最先流出层析柱，小方块次之，小圆圈最迟，从而实现了把这三种物质分离、纯化的目的。 1.2 层析操作中的基本概念 分配系数 可由Henry方程得出 Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度 保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一 阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相）的迁移率之比: 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的作用力大小 洗脱体积(平衡模型) 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 色谱柱的理论塔板数、塔板高度(理论板模型) 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N---理论塔板数 θR(tR)---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 理论塔板高度： L---柱长 1.3 层析分类 1).根据流动相与固定相分类 流动相:气相层析法、液相层析法和超临界流体层析法， 固定相:固体、液体和以固体为载体的液体薄层。 2).根据固定相的形状分类 液相层析法:纸层析法、薄层分析法和柱层析法。 纸层析法多用于分析目的的，而柱层析易于放大，适用于大量制备分离，是主要的层析分离手段 。 3).根据压力分类 压力:低压（压力一般小于0.5Pa）、中压（压力一般为0.4－4.0Pa）和高压（压力一般为4.0－40Pa）。 4).径向流层析 如图， 特点: 料液及流动相从柱的圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中心管流出。因此，径向流层析使溶质在半径方向上得到分离。径向流层析的优点是规模放大时半径不变，通过增大柱高提高处理能力，而增加柱高不会增大压降，对固定相的机械强度要求不高。大规模径向流层析可获得比轴向流层析更高的柱效率。所以，径向流层析更适于大规模分离过程，但柱设备造价较高，实际应用较少。 5).根据分离操作方式分类 根据操作方式可分为洗脱展开、迎头分析和顶替展开三种。 a.洗脱展开又称为洗脱层析，料液中的溶质根据其在固定相和流动相间分配行为的不同，在层析柱出口处被展开形成相互分离的层析峰。分离完全，层与层之间隔着一层溶剂。 b.迎头分析法与一般的固定床吸附相同，大量料液连续输入到层析柱中，直到在出口处发生溶质穿透。只有吸附力最弱的组分能以纯粹的状态最先从柱中流出，其他各组分不能分离。 c.顶替展开所采用的洗脱液中含有与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的物质，这种物质成为顶替剂。顶替剂将溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中依次顶替出来，此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分完全分离。 6).根据分配机理分类 液相层析法可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析、疏水性相互作用层析和亲和层析等。 1.4 层析过程的理论基础 层析理论模型：平衡模型 理论板模型 传质速度模型  b)理论板模型:将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板高为H。假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：