分子实验综合分析.docVIP

分子生物学实验报告 实验名称 实验目的： 学习分子生物学中最基本的技术--分子克隆（Molecular cloning，gene cloning）的操作过程。 掌握基因克隆的概念； 熟悉基因克隆的过程； 掌握基因克隆常用仪器设备的使用方法； 掌握PCR的原理； 了解DNA克隆的原理及蓝白斑筛选过程的原理 了解基因克隆的应用。 实验原理： 基本概念： 基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 感受态细胞：在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,质粒不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称ccDNA)。相对分子质量一般在1Kb-200Kb之间。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多个酶切位点、抗生素耐药性等。 限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 双链，形成一定长度的DNA 片段。 实验方法： 多聚酶链式反应是DNA的体外酶促扩增。是利用两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，使目的DNA片段在一定时间以指数方式增加百万倍。高温加热可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计基本原则： a) 序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 b) 引物长度以15-30 nt为宜,一般25nt。这样长度的寡核苷酸在聚合反应温度下不会形成稳定的复合物，更短的引物一般会降低扩增特异性； c) 碱基尽可能随机分布,G+C占45-50%。两条引物G+C含量应尽量相似； d) 引物内部避免形成二级结构，尤其是发夹结构 e) 两引物间避免有互补序列，特别是在引物3’端，即使无法避免，其互补碱基也不应大于2个碱基，否则容易生成引物二聚体或引物二倍体； f) 引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 无细胞分子克隆：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 试剂盒回收目的基因：采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。 目的片段与载体连接： a) DNA片段之间的连接主要是在T4 DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,需ATP。通常两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接： 同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端 不同种限制酶作用于不同DNA片段产生的同尾末端 PCR产物与Ｔ载体的连接 限制酶和其他方式产生的平末端。 b) T-A克隆：TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3‘末端加一个碱基A。据此，在质粒DNA 3’端突出一个T来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。应用于PCR产物克隆，代表商品化载体有pCRTMⅡ，pGEM-T。 5) 转化方法（热休克法）：当细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液中时，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 数秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培