基因工程第七DNA定点诱变.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * B. 多处缺失或变换2个bp以上的oligo 两侧需12-15bp 侧翼双链区的Tm应约为35-40℃ Tm=4(G+C)+2(A+T) =36℃ ( 3 each) 突变区域大, 效率越低(两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数→ 越低） 5. 模板/结果 靶DNA尽可能短，应测序确定其突变 二、Altered Sites ? II in vitro mutagenesis system 位点选择定点诱变法 三、Transformer Site-Directed mutagenesis 转化子诱变法 Synthesize second strand Digest DNA (primary digestion) Transform E.coli mutS to propagate plasmids Isolate and digest (Second digestion) Transform E.coli Isolate DNA 四 、 PCR定点诱变 1．同源重组法 2．DpnI法 3.重叠延伸 Overlap extension 对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链 五、SOE 重叠延伸剪接术 Splicing by overlap extension 可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接 设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；重叠部分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。 设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补 ATG ATG ATG ATG ATG ATG EcoRI BamHI BamHI ATG EcoRI ATG BamHI ATG EcoRI PCR PCR 重叠延伸 PCR 第二节 嵌套缺失 第二节 嵌套缺失 1. 外切核酸酶III的消化 Exonuclease III 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 2. BAL 31的消化 主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3’端去掉除单核苷酸， 还是一个内切核酸 (单链，nick, gap) 依赖 Ca++ EGTA可抑制活性 A A B A digestion vector insert BAL 31 B digestion Deleted inserts cloned to plasmid vector 3. DNase I 的消化 内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解 ds or ss DNA Mg2+: 独立作用于每条DNA链，位点随机 Mn2+: 大致在同一位置切割dsDNA 产生平端 或1-2个核苷酸突出 ccc DNA DNase I, Mn++ (low concentration) A digestion Klenow re-ligation EcoRI HindIII StyI StyI ScaI ClaI HindIII SalI FspI ClaI FspI KpnI EcoRI 1 660 950 1850 2100 2260 2700 3400 3430 3800 6000 6600 2230 6.6kb pR-1600 (1.6kb) pR-2260 (2.26kb) pR-2450 (2.45kb) pR-2570 (2.57kb) pR-2