多糖的电泳和层析技术研究进展.pptVIP

多糖的电泳和层析技术 多糖的化学性质 多糖（polysaccharide） 糖链 高分子碳水化合物 多糖：相同的单糖组成 eg—淀粉、纤维素和糖原 杂多糖：不同的单糖组成 eg—阿拉伯胶和肝素 1.一般不溶于水 2.无甜味 3.不能形成结晶 4.无还原性和变旋现象 多糖的药理作用 polysaccharide 抗肿瘤 抗病毒 降血糖 抗炎 抗补体 电泳技术 层析技术 多糖的电泳技术 多糖分子在一定pH值的缓冲体系中也会解离带电，带电的离子在电场 的作用下向一定的方向泳动，电荷和分子大小决定了分子泳动速率，根据泳动速率的不同即可分离多糖。多糖研究中用到的电泳方法主要有纸电泳、醋酸纤维膜电泳、凝胶电泳、毛细管电泳四种。 多糖电泳技术的原理 多糖的电泳技术—纸电泳 纸电泳原理 纸电泳是根据电泳现象在渗透了缓冲液的纸上加上电场使物质移动的电泳技术，根据支持物材质不同可分为滤纸电泳和玻璃纤维纸电泳两种。电泳采用的缓冲液以硼酸盐较普遍，因糖类物质中的相邻羟基易与硼酸离子结合，生成硼酸复盐，增加了电导性。 多糖的电泳技术—纸电泳 滤纸电泳操作步骤 8cm×24cm 滤纸条 载玻片线形点样 400V电泳2小时 乙醇固定 高碘酸溶液 70%乙酸溶液冲洗 亚硫酸品红 30min，糖处呈现紫红色 玻璃纤维纸电泳操作步骤 5cm×20cm 玻璃纤维纸 800V电泳40分钟 自然晾干，茴香胺硫酸溶液喷雾染色 100℃烘烤15分钟 显棕黄色 载玻片线形点样 多糖的电泳技术—醋酸纤维膜电泳 醋酸纤维膜电泳的原理 醋酸纤维素膜电泳是以醋酸纤维素膜为介质，其电泳原理与纸电泳基本相同。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成，溶于丙酮后可涂布成均一的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜。 多糖的电泳技术—醋酸纤维膜电泳 醋酸纤维膜电泳操作步骤 2cm×8cm 醋酸纤维薄膜 缓冲液 取出膜条 夹在两层滤纸内吸去多余的缓冲液 浸泡15min 1mm×5mm薄膜 浸渍样品溶液约1μL 紧贴在离膜条一端2cm处点样 250V，电泳20分钟 晾干，甲苯胺蓝溶液染色 90%的乙醇漂洗 多糖处为蓝色色斑 多糖的电泳技术—凝胶电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 淀粉凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 多糖的PAGE原理 由于多糖的分子量较大，高分离胶的浓度才能使线性酸性多糖分子像球状蛋白分子一样在电场的作用下实现分离，因此分离胶浓度一般选用7.5%~8%。多糖复合物的解离程度较微弱，电荷密度低又具有糖单元不均一性、不对称性，以致多糖的电泳带中呈带状分布，带状越明显，说明多糖的单元成分和结构就越复杂。 凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 判断海洋硫酸多糖相对分子量大小和分布情况 1.配制缓冲液 （1）分散缓冲液：硼酸3.09g， Tris 6.15 g， EDTA 1.86 g，加水溶解，定容至500 ml（pH 8.3） （2）上层缓冲液：甘氨酸46.92 g， Tris12.12 g，加水溶解，定容至500 ml （3）分离胶缓冲液：丙烯酰胺10 g， 亚甲双丙烯酰胺1.0 g， 蔗糖7.5g，用pH 8.3分散缓冲液溶解，定容至50 ml （4）浓缩胶缓冲液：丙烯酰胺2.375 g， 亚甲双丙烯酰胺0.125 g，溶于40 ml分散缓冲液中，用0.1 mol/ L 盐酸调pH 6.3，定容至50 ml 2.制胶 （1）分离胶缓冲液6 ml、10%APS 36μl、TEMED 6μl制成分离胶 （2）浓缩胶缓冲液2 ml、10% APS 60μl、TEMED 2μl制成浓缩胶 3.海洋硫酸多糖供试品上样 CHS1、CHS2、DPS和GAS各上样6μg 凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 200 V、温度25℃电泳2小时 0.5%的阿利新蓝溶液 水脱色 几种海洋硫酸多糖的PAGE 电泳图谱均呈带状分布 从而可看出其相对分子量呈连续分布 1.CHS2；2.对照品肝素；3.低分子肝素；4.CHS1；5.DPS；6.GAS 凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 谱图经图象扫描分析软件处理后可得到数字化图谱，求得CHS1、CHS2、DPS 和GAS的相对分子量分布分别为3 000~ 10 000、6 200~ 8200、4 000~