斑马鱼的性腺发育.pptVIP

卵巢壁:由两层被膜构成，外层为腹膜，内层为白膜。白膜由外到内依次为扁平上皮细胞、疏松结缔组织、间质组织和生殖上皮。 产卵板:白膜中的结缔组织向卵巢内部伸展与卵巢生殖上皮共同构成板层状结构，称产卵板，是卵子产生的地方。 卵巢腔:存在于卵巢内部的空腔，与输卵管相通。 不同龄雌鱼卵巢发育 0～16日龄:没有观察到性腺发育情况。 17～22日龄:原始生殖细胞没有两性分化，数量开始增多，并逐渐聚集成团，细胞质嗜酸性，核较大，嗜碱性，有一明显核仁。 27日龄:原始生殖细胞分化为卵原细胞，体积变大，数量增多，成排排列，在腹腔后背部分布，与肝胰脏相连。 32～57日龄:卵巢体积较小，位于腹腔后背部，靠近肝胰脏。卵巢内主要为第Ⅰ时相卵母细胞，细胞体积小，圆形，细胞质少，有一明显细胞核。核中部有1～2个核仁，核内染色质细丝状。 62日龄:主要为第Ⅱ时相卵母细胞，细胞为多角形、圆形。细胞质较多，染色较深，为淡紫红色。核相应增大，弱嗜酸性，核仁数个，靠近核膜内侧分布。卵母细胞外面有一层滤泡细胞。 67～72日龄:卵巢粗短，主要存在第Ⅱ时相和发育早期的第Ⅲ时相卵母细胞。早期第Ⅲ时相卵母细胞比第Ⅱ时相卵母细胞体积大，圆形或椭圆形，染色较浅，核周细胞质内出现少量空泡。细胞核较大，弱嗜酸性，核仁多个，分布在核膜内缘，被染成深蓝色。卵母细胞外周辐射带很薄，结构不明显，细胞外隐约能看到两层滤泡膜。 77日龄:以第Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞为主，大部分第Ⅲ时相卵母细胞处于发育中期。中期第Ⅲ时相卵母细胞近圆形，体积明显增大。胞质的空泡内出现了嗜酸性的卵黄颗粒，越靠近细胞核，卵黄颗粒越大。卵核体积增大，染色较浅，核仁多个，分布在核膜内缘。随卵母细胞的发育，核仁逐渐向核中央移动，呈深蓝色。细胞周围辐射带明显，并随着细胞体积的增大而增厚，细胞外两层滤泡膜发育明显。 82～90日龄:以第Ⅲ、第Ⅳ时相卵母细胞为主。晚期第Ⅲ时相卵母细胞体积较大，空泡内充满卵黄。第Ⅳ时相卵母细胞由于卵黄物质不断积累，细胞体积继续增大，圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞质。细胞核逐渐由中央向动物极移动。卵巢壁随卵母细胞的数量增多和体积增加而逐渐变薄，放射带明显增厚。 成熟小鱼:卵巢白膜变得很薄。卵巢以第Ⅴ时相卵母细胞为主，也存在有发育早期的卵母细胞。第Ⅴ时相卵母细胞已充分发育，呈圆球形，卵黄颗粒相互融合，细胞质中充满粗大的卵黄颗粒，散布于整个卵母细胞的胞质内。至此，卵母细胞发育成熟，不久，核膜崩解、消失，卵母细胞进入第2次成熟分裂中期，形成次级卵母细胞，排到卵巢腔。 产卵后小鱼:卵巢细长，结构松散，包含有排卵后的空滤泡、第Ⅱ时相、第Ⅲ时相和第Ⅳ时相卵母细胞。 Ⅰ期：初级生长期(primary growth stage)，卵母细胞(卵泡)体积小(7~140μm)，卵母细胞开始生长。 Ⅱ期：皮质泡时期(cortical alveolus stage)，卵泡直径140~340μm。卵母细胞体积进一步增大，卵母细胞外周的皮质区出现许多小泡。 Ⅲ期：卵黄增生期(vitellogenesis stage)，卵泡直径340~690μm。卵母细胞体积增加很快，卵黄颗粒物质快速积累，越靠近细胞核，卵黄颗粒越大。 Ⅳ期：卵母细胞成熟期(oocyte maturation stage)，卵泡直径690~730μm。由于卵黄颗粒数量和体积的增长，圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞的细胞质。 Ⅴ期：成熟卵期(mature egg stage)，卵泡直径730~750μm。卵母细胞成熟，细胞内充满了粗大的卵黄颗粒。 人工受精 将鱼放入冰水中，直至不太活动为止。 雌鱼：轻压腹部，卵子流出。收集到小培养皿中。 雄鱼：同雌鱼。加1mlD-hanks液稀释。 将稀释精子加入卵子中。 斑马鱼卵巢的获得 发育成熟且腹部膨大的雌性斑马鱼体表用75％酒精消毒，用眼科剪小心剪开腹部后，迅速用眼科镊取白色半透明的两侧卵巢置于已除菌的清洗液D-Hank溶液中 卵细胞培养 取20-30个卵细胞于直径35mm无菌培养皿中，加人3ml培养液，封口，于培养箱内27℃、饱和湿度条件下成熟培养18h。 成熟判定 卵母细胞的成熟是一个包括细胞核、细胞质、细胞膜、透明带等多方面在内的复杂生物学过程。在形态上表现为生发泡破裂，核仁消失，纺锤体形成，染色质浓缩为染色体，第一极体的排出，卵丘、颗粒细胞的扩散、膨胀和透明带的软化等。 本试验以生发泡破裂即细胞核的消失判定卵细胞成熟。 将培养后的卵细胞置于透明液(clearing solution)中固定，在倒置显微镜下观察。无细胞核的卵细胞既是已发生生发泡破裂(GVBD)的成熟卵细胞。 卵母细胞的完整性观察 解剖镜下对用两种方法获得的斑马鱼卵母细胞进行形态学观察 细胞存活率的测定 取同一条鱼的两侧卵巢，解剖镜下，对培养前和18小