细胞生物学第三章细胞生物学研究方法详解.ppt

第三章 细胞生物学研究方法 1974年Steffensen等从HeLa细胞的多核糖体中分离出5SrRNA，并以125I标记制成探针，并测探出5SrRNA的基因在染色体上的位置。 具体过程是这样的，首先对载片上的人体细胞中期染色体进行原位变性，并加入探针，这时，探针只能和产生它的模板DNA互补，即进行分子杂交，而其他部位则不行。放射自显影暴露二个月后，发现在所有制片的染色体组中，一对一号染色体均被标记，标记的位置是短臂末端，这说明5SrRNA基因位于第一号染色体的短臂末端。 原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的。 近年来随着免疫电镜技术的不断进步， 电镜原位杂交技术也得到了发展。 电镜原位杂交和光镜原位杂交的 基本原理是一致的 区别是探针的标记物不同，一般以生物素等一些小分子取代同位素或萤光素来标记特异核苷酸序列来制作探针进行原位杂交。然后用与胶体金相连的生物素的特异性抗体对原位杂交样品进行免疫反应，这样就可在电镜下观察到探针的位置。 近些年发展起来的免疫细胞化学（immunocytochemistry)开创了这方面研究这项技术主要是利用抗原和其相应的抗体能作特异性结合即免疫反应这一原理，来定位组织或细胞中蛋白质抗原成分的一类技术。 我们可以利用这一技术来对蛋白类抗原进行定位定性分析。虽然抗原和抗体的结合具有高度的敏感性和特异性，但是抗体与抗原的结合是看不见的，为了解决这一问题，早在四十年代Coons巧妙的使荧光素和抗体项结合，然后用这种被标记的抗体同被检测的抗原进行免疫反应，这样就很容易在荧光显微镜下检测到组织或细胞中的抗原 。 免疫酶标记技术、免疫铁蛋白技术。特别是1971年Faulk和Taylor创造的免疫胶体金技术。这项技术的特点是，胶体金能迅速而稳定地与蛋白质即抗体相结合，这是一种由于蛋白质被胶体金表面负电荷吸引而结合的过程。这种结合主要是物理过程，不会影响蛋白质的活性，另外金颗粒容易识别，能产生强烈的二次电子，是理想的扫描电镜的标记物。 三 细胞动态分析的方法 第一位在这个方向上努力的是德国生物化学家努普（Franz Knoop）。 早在1904年他就用苯环标记脂肪分子对脂肪代谢研究，得出了在体内脂肪代谢过程中脂肪分子每次断裂下两个碳原子的结论。这个结果被40年后的进一步研究所证实。1913年德国化学家帕内斯（Fridrich Adolf Paneth）等人想到了可以用放射性同位素标记生物大分子来研究大分子在细胞中的动态。这样就有了放射自显影技术（radioautograpgy）。 。放射性同位素技术所以能被应用是由于存在两个基本条件， 一是放射性同位素不影响机体的正常代谢。 二是机体细胞对某种元素及其不稳定同位素 “一视同仁”。该项技术的应用使得细胞生物学取得了很大的进展，例如象柠檬酸循环，DNA半保留复制的证明等。 制造带有放射性同位素的小分子并不复杂，只要把普通化合物放在核反应堆里用中子轰击，取出后就带有放射性同位素了。如今用于标记的几乎所有小分子前体都可以通过商品销售得到。 放射自显影术不但在定位研究上有灵敏度高， 定位精确的特点，它还是动态研究中最有效的手段 针对活细胞一般都采用放射自显影的追踪标记 也称脉冲标记(pulse—chase)的方法。 这种方法是先用带同位素标记的前体分子 掺入到生活细胞的代谢中去，标记一段时间 后便把它彻底洗掉，再用不带标记的前体分子代替。 然后在不同时间取样并分析同位素的量和它所在的 位置，从而了解它们的代谢途径。 第三节 细胞培养技术 1885年，德国学者Roux发现鸡胫细胞可在温热的生理盐水中存活一段时间，他称这项试验为 “explanation” ，即体外种植的意思。1907年美国动物学家Harrison从两栖类胚胎中取下一块神经管组织，放在一滴淋巴液中作悬滴培养，他观察到了神经管分化或神经元，并且向培养液中伸出了轴突。这些可以说是细胞培养的开拓性工作。从这些工作可以看出细胞培养(cell culture)是指将细胞从机体中分离出来，进行体外培养的技术。 一 动物细胞培养技术 二种类型，一类是贴壁依赖性细胞，大多数动物细胞都属这一类型，另一类型是非贴壁依赖性细胞，比如来源于血液，淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞属于这一类型。 贴壁培养 接触抑制(Contact inhibition)。然而接触抑制实际上只抑制了细胞的运动而并没有抑制细胞的分裂。所以我们看到细胞长满生存平面后仍能继续分裂，直到细胞达到一定密度，才停止分裂。这后一种抑制叫密度抑制（Density innibition）。 这时如果要细胞继续分裂增殖就要进行及时的分散，分瓶接种于新鲜培养基中继续培养。这一过程叫传代培养（Subculture）。 这种直接从有机体取出的细