第讲基因工程的酶学基础重点分析.ppt

生物技术核心课程 第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的克隆与分离 第六讲 克隆基因的检测与功能鉴定 第七讲 克隆基因的表达与产物纯化 第八讲 基因表达的调控 用于核酸操作的工具酶 5.平末端DNA片段的连接   连接平末端DNA 分子的方法除了直接利用T4DNA连接酶外，还可以先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶进行连接。  常用的平末端DNA片段连接法： （1）同聚物加尾法 （2）衔接物连接法 （3）接头连接法 （1）同聚物加尾法 利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能，它能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3’—OH基团上。 （1） 同聚物加尾法 Poly（dA）尾巴：在由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3’—OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸，这样的延伸片段，称之为Poly（dA）尾巴。 Poly（dT）尾巴：如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么这种DNA分子的3’—OH末端将会形成Poly（dT）尾巴。 Poly（dA）尾巴同Poly（dT）尾巴是互补的，因此任何两条DNA分子，只要分别获得Poly（dA）尾巴和Poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。按照同样的道理，也可以用给DNA分子3’—OH末端加上Poly（dG）尾巴，给另一种DNA分子3’—OH末端加上Poly（dC）尾巴的方法，使2个不同DNA分子连接起来。 (2)衔接物连接法 衔接物：是指用化学方法合成的一段由10—12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 （3） DNA接头连接法 DNA接头：是一类人工合成的一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。图3—13所显示的是一种具BamHⅠ粘性末端的典型的DNA接头分子。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组 。 （3）非放射性标记DNA片断的3’端 AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA AAA AAA HindⅢ位点 HindⅢ位点 连接 催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等） 二、T4多核苷酸激酶 1. 来源 T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。 2. 功能 催化?磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。 不论5’-OH端突出与否。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ ATP T4多核苷酸激酶 如果ATP的?磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。 但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。 3. 多核苷酸激酶的用途 DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP 多核苷酸激酶 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 碱性磷酸酶 （1）正向反应（forward reaction） （2）交换反应标记法 反应混合物中具有超量(?-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(?-32P)ATP的?-32P与DNA5’端的磷酸交换。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP、ADP 多核苷酸激酶 反应效果不理想。 三、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来。 Bacterial alkaline phosphatase，BAP （1）细菌性碱性磷酸酶 （2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。 具有抗热性。 SDS中加热68oC可完全失活。 2. 碱性磷酸酶的特性 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 碱性磷酸酶 3. 碱性磷酸酶的功能 （1）防止线性化