SODMDA实验详解.pptVIP

NBT法测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)活力植物组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定 背景知识 植物在逆境胁迫或衰老过程中发生一系列生理生化变化: 如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调、活性氧的积累等。 生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O2.-)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O21)等。 活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。 植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统： 酶促防御系统: SOD、CAT、POD和APX等 非酶促抗氧化剂: ASA和GSH等 丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 背景知识 实验目的 实验原理 实验材料与设备 实验步骤 注意事项 结果比较分析 思考题 NBT法测定SOD活力 实验目的 了解胁迫反应的具体机制（膜脂过氧化 抗氧化） 了解抗氧化防护酶的测定方法，掌握NBT法测定SOD活力 实验原理 SOD催化下列反应： 2O2.-+2H+→H2O2+O2 本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。 光 SOD H2O2 核黄素+甲硫氨酸 O2.- + NBT →甲腙（560nm） 光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 SOD酶量与光化还原抑制百分率在一定范围内呈线型关系，一般以引起50％光化还原抑制率的酶量为一个酶活力单位 材料、仪器设备及试剂 植物生理生化实验 p172-173 （一）材料与处理：小麦幼苗（盐处理与否）叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进 样器；4.荧光灯；5.试管数支。 （三）试剂： 0.05 mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH7.8） 195 mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液 1.125 mmol/L 氮蓝四唑NBT溶液 100 umol/L EDTA溶液 60 umol/L 核黄素溶液 SOD活性计算 SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 (Ack－AE)×V Ack×0.5×W×Vt Ack照光对照管的吸光度 AE样品管的吸光度 V样品液总体积（ml） Vt测定时样品用量（ml） W样鲜重（g） SOD总活性(U/g)＝ 实验步骤 1. 酶液提取：取1 g材料（CK 盐处理）于预冷的研钵中，加5 ml预冷磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，2000 g(4℃) 离心15 min，上清液即为SOD粗酶液。 2. 显色反应：取5ml试管4支，2支为测定管，另2支为对照管。 反应体系中各试剂的终浓度为130 mmol/L Met，75 μmol/L NBT， 4 μmol/L 核黄素， 100 nmol/L EDTA，按下列次序及量（ml）加入各溶液： 1 CK 2 盐处理 3 4 暗管 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素