基因工程笔记要点.docVIP

加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 PCR技术的特点： 1）高度的灵敏性（1 copy 109）； 2）特异性，引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 3）操作简便易行， PCR扩增法只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 4）用途广泛，生命学科、医学工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学。 PCR的反应体系和方法： PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 反应体系（总体积：50-100ul) Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 PCR反应条件 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 （2）引物浓度 0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50ul，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度、四种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量、dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 (1)变性：使双链DNA解链为单链，94oC 20-30秒 (2) 退火：温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 (3)延伸：70-75℃,一般为72℃，延伸时间由扩增片段长度决定 (4)循环次数：主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次，次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加 经典循环参数（1000bp以内） 94℃ 5min 94℃ 30s 55℃ 45s ×30次 72℃ 1min 72℃ 7min 4℃ forever PCR的类型 1）不对称PCR：目的：扩增产生特异长度的单链DNA。用途：制备核酸序列测定的模板、 制备杂交探针、基因组DNA结构功能的研究 2)反向PCR (reverse PCR) ：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 3）多重PCR（复合PCR）：用于检测特定基因序列的存在或缺失。 4）LP-PCR（Labelled primers)：利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断 5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）：对于未知序列和具有不同末端序列--锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增。 6）PC