整胚原位杂交.docVIP

组织学与病理学技术实验报告 实验名称：使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚 her4 基因的表达 使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚胎her4 基因的表达 一、实验目的： 1）通过本实验掌握原位杂交的基本原理及方法。 2）观察her4基因在斑马鱼胚胎的表达位置。 二、实验原理： 原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。水4%聚甲醛、PBS溶液、甲醇（70%、50％30％蛋白酶K的PBST溶液在管中原有的约1mlPBST中加入1 μl 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 μg|mlPBST溶液HYB溶液RNA探针50%甲酰胺2×SSCT溶液SSCT溶液羔羊清:MABT=1:9的溶液AP底物染色缓冲液原位杂交中溶液的配制： 保存溶液配制 PBS: 每1L溶液： 1.37M(mol/L的简写NaCl 80g 27mM KCl 2g 43mM Na2HPO4 ·12HO(14.7g)或无水Na2HPO4 （6.1g） 14mM KH2PO4 1.9g DEPC水（购买） 1L HCl 调PH值至7.灭菌PBST： PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。 20*SSC: 88g 3M NaCl 175.3g DEPC水 至1L 灭菌 SSCT： SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。 HYB：甲酰胺 加入Tween-20使其终浓度为0.1% 5）MAB：11.69g 150 mM NaCl 8.89g 用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.5 4保存 MABT： MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%. 现配溶液阻断溶液 2500ul热处理羔羊血清:10%BM阻断试剂:MABT=1:2:7。用后剩余溶液丢弃，防止血清变质。 检测缓冲液又称AP缓冲液 每l溶液 H2O μl 100mM NaCl 400 μl 50mM Mgcl2 1000μl 100mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris）HCl 2000 μl 10% Tween─20; 200ul 3）碱性磷酸酶底物染色缓冲液 检测缓冲液 1ml NBT/BCIP 20 μl℃冰箱、光学显微镜、正置相差 荧光显微镜、恒温水浴锅、24孔板收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用4%多聚甲醛固定，在4保存，二十四小时后用PBS溶液洗入水相，显微镜下剥去卵膜，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用。 重新水化和固定 1） 吸取固定好的胚胎，加入70%甲醇（MeOH）的PBST溶液，放置5分钟。 2） 置换成50％甲醇的PBST溶液，放置5分钟 3） 置换成30％甲醇的PBST溶液，放置5分钟 4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。 用蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1 μl 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 μg|ml）在室温下处理胚胎，时间可参考下表： 胚胎时期 处理时间 5S 酌情处理 6S 30秒 16S 1分钟 18S，24 2分钟 48h(H2O2脱色) 4分钟 3d(H2O2脱色) 10分钟 消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗。 ） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。预杂交 1）每个管中置换成大约300μlHYB溶液.(溶液覆盖胚胎） ）65℃水浴，预杂交4小时以上。 杂交 1）用HYBRNA探针稀释μl(200ulHYB+6ul探针)，72℃温育5分钟，再冰上放置以破坏形成的可能防碍杂交的二级结构。 2）吸去预杂交的HYB，探针的HYB溶液