中国矿业大学生物工程本科毕业答辩精要.pptVIP

LOGO CHINA UNIVERSITY OF MINING AND TECHNOLOGY PCR-荧光探针法检测CYP 2C19基 因多态性与DNA测序法的比较 答辩人： 导 师： 目 录 研究背景 1 实验方法 2 实验结果 3 分析讨论 4 中国心血管病报告2013 我国每年约有350万死于心血管病，平均每10秒钟就有一人死于心血管病。 表-心血管病患病人数 疾病 患病人数 心血管病 2.9亿 高血压 2.7亿 脑卒中 700万 心肌梗死 250万 心力衰竭 450万 肺原性心脏病 500万 风湿性心脏病 250万 先天性心脏病 200万 中国心血管病报告2013 图-1990年~2012年中国城乡居民心血管病死亡率变化 死亡率（1/10万） 国家药品不良反应监测年度报告（2013年） 图- 1999-2013年全国药品不良反应/事件报告数量增长趋势 实验技术 1、限制性片段长度多态性分析法 利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段。后将这些片段电泳、转膜、变性，与标记过的探针进行杂交，洗膜，即可分析其多态性结果。 2、高分辨率熔解曲线 基于碱基熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术。 3、将已知序列的核酸探针固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面。 实验技术 图-TaqMan PCR反应模式 （A）聚合反应：（B）链置换；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物） 表-CYP 2C19基因分型突变PCR-荧光探针法检测结果分析 检测名称 Ct值 结果 判断 CYP 2C19* 2 （G） Ct=A B-A≥3.3 G/G基因型 CYP 2C19* 2 （A） Ct=B |B-A|≤3.3 G/A混合型 ? ? A-B≥3.3 A/A基因型 CYP 2C19* 3 （G） Ct=C D-C≥3.3 G/G基因型 CYP 2C19* 3 （A） Ct=D |D-C|≤3.3 G/A混合型 ? ? C-D≥3.3 A/A基因型 药物反应 研究背景 身高/体重 性别/年龄 合并症 病例史 遗传 CYP 2C19与氯吡格雷 研究背景 CYP 2C19基因多态性 研究背景 等位基因 碱基突变 酶活性 中国人频率 CYP 2C19* 1 无 正常 65% CYP 2C19* 2 681GA 无活性 30% CYP 2C19* 3 636GA 无活性 5% 表-中国人群CYP2 C19等位基因分布频率 到目前为止已发现 CYP 2C19 至少存在 14 种突变基因和 18 种等位基因。 美国FDA发出黑框警告，患者服用波立维前需检测CYP 2C19基因型。 PCR-荧光探针法 体系配置 条件设定 观察结果 PCR 反应液12.5μL 引物探针混合液7.5μL 模板DNA 2μL 灭菌水 3μL UDG酶反应，37 ℃ 2分钟 预变性，95 ℃ 3分钟 变性，94 ℃15秒 退火、延伸，60 ℃ 35秒 质量控制 实验方法 PCR-荧光探针法实验结果 1 实验方法 图-CYP 2C19* 2基因野生型G/G 图-CYP 2C19* 2基因杂合型G/A CYP 2C19* 2G CYP 2C19* 2A 图-CYP 2C19* 2基因纯合型A/A PCR-荧光探针法实验结果 2 图-CYP 2C19* 3基因野生型G/G 图-CYP 2C19* 3基因杂合型G/A CYP 2C19* 3G CYP 2C19* 3A 实验方法 DNA测序法 实验方法 测序产物 纯化、上机 测序 PCR反应 扩增反应 扩增产物 酶解 测序结果 分析 DNA测序法结果 实验方法 图-CYP 2C19* 2野生型G/G 图-CYP 2C19* 2杂合型G/A 图-CYP 2C19* 2纯合型A/A 图-CYP 2C19* 3野生型G/G 图-CYP