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最初尝试着发展能操作大片段DNA分子的载体集中在λ噬菌体上。 λ噬菌体具有感染细菌的能力，并通过裂解周期而指导合成新的λ噬菌体颗粒（复制）。 Λ噬菌体的裂解性及溶源性感染周期 λ噬菌体基因组的大小为48.5kb，其中有15kb片段为“随意”区域，这些片段可以被删除而不影响噬菌体感染细菌的能力，也不影响其通过裂解周期的复制。 λ基因组包含随意DNA 已经发明了两种类型的载体。 - 插入型载体（insertion vector）：在该载体中部分或者全部的随意DNA被删除，并在删切后的基因组内部的某些位点引入一个单一的限制性酶切位点。 - 替代型载体（replacement vector）：在该载体中随意DNA位于一填充片段内，两侧有一对限制性酶切位点，当要克隆的DNA连接到该载体时这个区段就被取代。 插入型及替代型载体 λ噬菌体基因组是一个线性分子，但该分子的两个固有末端具有12个核苷酸的单链突出，称为cos位点，两个末端序列互补，因此可以相互间形成碱基配对。因此λ克隆载体可以作为环状分子像质粒一样操作。 2.2.3 用于更长DNA片段的载体 克隆文库的构建需要能容纳更长DNA片段的载体，克隆文库即是插入的片段覆盖了整个基因组的克隆集合，用来为基因组测序计划提供材料。 λ克隆载体可以克隆长达18kb的DNA。如果用来克隆人DNA，基因组的任何一段在该文库中出现的概率达95%时则需要50多万个克隆。 用不同类型的克隆载体制备的人基因组文库的大小 1. 考斯质粒 -具有λcos位点的质粒（质粒-噬菌体的杂交体） 含有cos质粒，与真正的λ噬菌体一样具有感染性，但一旦进入了细胞考斯质粒就不能指导合成新的噬菌体颗粒而是如质粒一样进行复制 考斯质粒可以插入的新DNA高达44kb。这将人类基因组文库克隆减少到大约25万个，与λ文库相比是一大进步，但操作起来的克隆量仍然很大。 一种有代表性的考斯质粒pJB8大小为5.4kb，含有氨苄青霉素抗性基因（ampR）、有cos位点的λDNA片段及大肠杆菌的复制起始位点（ori） 2. 酵母人工染色体 在尝试克隆大于50kbDNA片段时的第一个主要突破来自酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）的发明。 YAC载体在酿酒酵母而不是在细菌中繁殖，而且是以染色体而不是质粒或者病毒为根据的。 天然染色体具有三个重要的组件 - 着丝粒：在核分裂过程中起关键作用 - 端粒：染色体DNA分子末端的特殊序列标志 - 一个或者多个复制起始位点：当染色体分离时启动新DNA的合成。 真核染色体的关键性结构成分 在YAC中，构成这些染色体的3个组件与一个或多个选择性标记物、至少一个限制性酶切位点连接起来，酶切位点是为了能插入新的DNA。 标准的YAC能够克隆600kb的片段，某些特殊类型的YAC能处理长达1400kb的DNA片段。这是所有类型克隆载体中容量最大的载体。 pYAC3克隆载体 环形载体用BamHI及SnaBI进行切割。BamHI切割将环形分子中两个端粒之间的填充片段去掉。SnaBI在SUP4基因中切割产生新DNA插入的位点。这个结构包含TRP1及URA3筛选标记物，因此能合成色氨酸和尿嘧啶，该细胞才能在缺乏色氨酸和尿嘧啶的限制性培养基上生长并形成克隆。插入在克隆载体分子上的DNA可以通过检测SUP4的活性来鉴定。这可以通过颜色反应来进行：在适当的培养基上，含有重组载体的克隆是白色的；而非重组子是红色的。 不幸的是，一些类型的YAC载体有插入不稳定的问题，即克隆的DNA重排形成新的序列组合。 3. 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome，BAC） 是基于天然的大肠杆菌F质粒构建的。与早期质粒载体不同，F质粒比较大，能克隆300kb及更长的片段，并且插入的片段很稳定。BAC是目前克隆大片段DNA最常用的载体。 4. 细菌噬菌体P1载体（bacteriophage P1 vector） 与λ载体很相似，以天然噬菌体基因组的缺失形式为基础。P1载体能克隆的DNA片段比λ子安泰大，可以克隆长达125Kb的片段。 4. P1衍生的人工染色体（P1-derived artificial chromosome，PAC） 综合了P1载体和BAC的特点，具有克隆长达300kb片段的容量。 5. Fosmids 包含F质粒的复制起始位点和λ载体的cos位点。它们与考斯质粒相似但在大肠杆菌中的拷贝数比较低，这意味着出现不稳定性问题的倾向较低。 2.3 聚合酶链反应（PCR） 克隆是一门强有力的技术，但是一个耗时且在某种程度上很困难的过程。 PCR有助于使DNA克隆取得相同的结果-特定DNA片段的纯化，而费时