2-2免疫组织化学技术分析报告.pptVIP

第四章、免疫组织化学技术 Immunohistochemistry 吉林大学白求恩医学院 组织胚胎学系 李树蕾 2012-11-6 （二）冰冻切片免疫组化染色 1.恒冷箱切片：新鲜组织或－80℃保存 组织切片10-14um； 2.裱片和晾干,密封-20℃短期保存 ； 3.染色前冷丙酮4℃固定10-20分，PBS冲洗2次×5min； 4.必要时细胞膜打孔。 5.通常苏木精复染细胞核，水溶性封片剂封片。 (三)培养细胞免疫细胞化学染色 1.固定 贴壁细胞制备细胞爬片；悬浮细胞制备滴片或者甩片 4%多聚甲醛或冷丙酮室温固定10-20min 2.晾干 易脱片的细胞大于2h， PBS冲洗2次×5min； 3.细胞膜打孔 二、SABC法与免疫组织化学染色其它方法比较 （一）SP法或SAP法 （二）EnVision TM Systems 将多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣根过氧化物酶结合形成聚合物, 代替传统方法的二抗和三抗, 直接与特异性第一抗体结合，放大了抗原抗体结合的信号，使检测变得简单而且敏感性增加。 （三）Maxvision法 根据聚合物技术把过氧化物酶与抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚肽上形成多聚物分子，可以避免由于生物素引起的非特异性背景显色. 三、免疫组织化学染色结果评价 排除非特异性染色、假阴性、假阳性结果 阳性对照实验 阴性对照实验 非特异性染色 细胞和间质染色无区别，或间质更强 染色无特定部位、无结构性 染色分布无规律，某一部位均匀染色 染色出现在干燥部位、边缘、刀痕、组织折叠处。 （一）以抗原表达模式定位 1．细胞质内弥漫性分布，即胞质型阳性反应； 2．细胞核周边胞质内分布，其判别要点是细胞核轮廓被勾画得很清楚。 3．胞浆内局限点状阳性反应。 4．细胞膜线性阳性反应，大多数淋巴细胞标志物的染色均如此。 5.细胞核阳性反应如BrdU及雌、孕激素受体蛋白等。 有些抗原的阳性表达也可同时出现在细胞的不同部位，如细胞质和细胞膜等。 (二) 阳性染色结果定量 1．计算免疫反应阳性细胞数 每个样品中10个非重叠视野；至少三个条件相同的样品；柱形图； 2．以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定 阴性 0~25个 ﹢ 25~50 ﹢ ﹢ 50~75 ﹢ ﹢ ﹢ ﹥75 3. 图像分析系统检测阳性结果（详见第七章） 四、讨论 （一）实验计划 目的 拟用方法 操作流程方案 预期结果 分组 试剂准备:一抗 二抗的种类和效价 器材准备：冰箱 湿盒 免疫组化笔 玻璃笔 滤纸等 设置对照 对每一抗体均应配阳性和阴性对照。 （二）抗体的稀释度 最佳抗体浓度可提高染色质量，与周围组织形成良好对比 表4-1.确定一抗的最佳工作浓度 一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性染色背景强度 1:50 十十十十 十十 1:100 十十十 十 1:200 十十 一 阴性对照 一 一 在一抗稀释度1:100和1:200之间可找出最佳稀释度。 抗体的种类（多、单克隆抗体；即用、浓缩抗体） 抗体的稀释液： 10mg/ml BSA和0.05 (v/v)% Tween 20 加入0.01molPBS 液 (三)滴加抗体注意事项 （组织切片、细胞培养） 吸掉多余液体；注意：避免碰到组织或细胞 避免干燥；注意：一次处理少数切片 滴加抗体在组织表面 免疫组化笔适用于培养细胞，注意：轻摇动数秒，使抗体分布均匀 （四）抗体的保存 1．抗体分装 浓缩型-20℃冰箱保存 2．抗体稀释 用前涡旋混匀，4℃，1-2个月 3．无菌与消毒 与抗体接触的工具消毒 (五) 对照实验 非常重要 常用的对照组有以下几种： 一、阳性对照 用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。 每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染色过程中各个步骤以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。特别是当待检的标本为阴性结果时，阳性对照呈阳性反应，可排除待检标本假阳性的可能。所以若预期染色结果是阴性时，就