09固定化酶分析报告.pptVIP

固定化酶 一、前言 作为一种生物催化剂，酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和及反应容易控制等特点。但是在使用酶的过程中，人们也注意到酶的一些不足之处： 1. 酶的稳定性差 2. 酶难以回收在利用，难以实现连续化反应 3. 反应产物分离纯化困难 固定化酶 所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收与重复利用。与游离酶相比： 与底物、产物分开，重复利用，酶制剂成本下降 稳定性一般有所提高 可以在酶反应其中连续进行催化反应 酶反应条件易控制，可以实现自动化控制 酶反应产物易于分离、纯化，简化工艺 反应所需空间小 酶的固定化方法 制备固定化酶的方法有很多，一般分为三大类： 1. 载体结合法： 物理吸附法、离子结合法和共价结合法 2. 交联法 3. 包埋法 凝胶包埋法、微胶囊法 Approaches to enzyme immobilization, reversible methods. 活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、硅胶、羟基磷灰石、大孔合成树脂 DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amerlite IRA-93等阴离子交换剂和CM-纤维素、Amerlite CG-50、Dowex-50等阳离子交换剂 亲和配基(凝集素) Eschericia coli β-galactosidase 二硫苏糖醇DTT Approaches to enzyme immobilization, irreversible methods. 赖氨酸 半胱氨酸 天冬氨酸和谷氨酸 凝胶、纤维膜 明胶、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠 包埋在高分子半透膜中 几微米到几百微米 胶囊和脂质体 硝酸纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等 双功能试剂或多功能试剂 戊二醛、乙二胺、顺丁烯二酸酐等 酶的固定化方法 固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 制备难易 易 易 难 较难 较难 结合程度 弱 中等 强 强 强 酶活回收率 高，但酶易流失 高 低 中等 高 对底物专一性 不变 不变 可变 可变 不变 再生 可能 可能 不可能 不可能 不可能 固定化成本 低 低 高 中等 低 酶的固定化方法 选择酶固定化方法一般遵循以下几个基本原则： 必须注意维持酶的催化活性 应该有利于生产自动化、连续化 固定化酶应有最小的空间位阻 固定化酶成本要低，且有较高的稳定性 固定化酶与底物、产物易于分离 充分考虑到固定化酶制备过程和应用中的安全性 固定化酶的性质 由于固定化在一定程度上会引起酶结构的改变，同时催化作用由均相反应转变为非均相反应，由此带来的扩散效应、空间位阻、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。 固定化酶的性质 固定化酶的稳定性 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度 对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高 对不同pH值的稳定性有所提高 对蛋白酶的稳定性有所提高 对贮存稳定性和操作稳定性均有所提高 原因：酶分子与载体多点连接，防止结构伸展变形、酶活力的缓慢释放、抑制酶的自降解 固定化酶的性质 2. 固定化酶的最适pH值 载体的带电性质 酶催化反应产物的性质 固定化酶的性质 3. 固定化酶的最适温度 由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，胰蛋白酶以交联法用壳聚糖固定化后，其最适温度为80 oC，比固定化前提高了30 oC。当然，也有些酶固定化后最适温度不变或有所下降。 固定化酶的性质 4. 固定化酶的底物特异性 底物为小分子，固定化前后底物特异性无明显变化 底物为大分子，固定化酶后的底物特异性往往会发生变化。 影响固定化酶反应动力学的因素 游离酶经固定化后，其动力学特征将发生很大的变化。固定化酶反应动力学较游离酶反应动力学复杂得多，影响因素也是多方面的，引起这种固定化效应（即动力学行为）发生变化的因素主要有： 酶结构的改变：共价结合，酶活性降低 微环境的影响：载体亲疏水性和介质介电常数 位阻效应：底物与酶分子无法结合 分配效应：载体亲疏水性、带电性 扩散效应：外扩散限制和内扩散限制 固定化酶在食品工业的应用 1. 在乳制品生产中的应用 牛奶中琼脂糖载体固定的β-半乳糖苷酶 干酪生产中离子吸附法固定的牛凝乳酶 2. 在茶饮料生产中的应用 茶汁风味改良中的β-葡萄糖苷酶； 茶饮料澄清和增香作用的单宁酶和β-葡萄糖苷酶 3. 在果汁生产中的应用 果汁澄清中琼脂糖、铜离子螯合固定漆酶除苯酚 果汁食品风味改良中丝素蛋白固定β-葡萄糖苷酶 果汁苦味改良中的醋酸纤维固定柚皮苷酶 固定化酶在食品工业的应用 4. 在啤酒生产中的应用 啤酒澄清中磁性聚乙二醇胶体粒子固定胰蛋白酶 5. 在食品添加剂和调味剂生产中的应用