DNA重组技术的基本工具白重点分析.ppt

一、对基因工程概念的理解 1、基因工程别名： 2、操作对象： 3、操作环境： 4、原理： 5、操作水平： 6、目的： * 1.1 DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术或基因拼接技术 体外 基因重组 DNA分子水平 基因 定向地改造生物的遗传特性 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 脱氧核苷酸的结构 磷酸二酯键形成 T 1 2 3 4 5 A 1 2 3 4 5 H H H H HO T 1 2 3 4 5 A 1 2 3 4 5 H H H H O H2O + 1.基因的“剪刀”──限制性核酸内切酶(限制酶) 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。 二、基因操作的工具 ①作用特性： ②结果： 　　产生两个黏性末端或平末端的DNA片段。 专一性 来源 种类 主要从原核生物中分离纯化而来 已经分离出大约4000种 　 黏性末端　　　　 黏性末端 EcoRI限制酶的切割 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 只能识别GAATTC序列， 并在G和A之间切开。 中轴线 平末端　　　平末端 SmaI限制酶的切割 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 中轴线 断开的是磷酸二酯键即脱氧核糖、磷酸之间的连接。 A T G G C A T C T T C G A A 思考:限制性核酸内切酶是使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的什么结构断开。 G A A T T C C T T A A G 1、被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ 思考: 具有 一般形成的黏性末端不同 2、被不同的限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ 限制酶A识别： -A T G A T C A T- -T A C T A G T A- ，切割位点是T与G之间； 限制酶B识别： -C A G A T C T G- -G T C T A G A C- ，切割位点是A与G之间 那么，它们产生的粘性末端就相同， 都是： — G A T C — 特殊情况 -A T -T A C T A G G A T C A T- T A- 寻根问底 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 寻根问底 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 1、下列关于限制酶的说法正确的是( ) A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少 B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端 D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键 B 解析：限制酶主要分布于微生物。到目前为止，细菌是限制性内切酶，尤其是特异性非常强的I类限制性内切酶的主要来源。 巩固训练 2.基因的针线——DNA连接酶 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即连接磷酸和脱氧核糖形成磷酸二酯键，这样一个重组的DNA分子就形成了。 两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 DNA连接酶的缝合作用 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！ DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低 DNA连接酶的缝合作用 DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？ 迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。 寻根问底 类型 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复 磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端(效率较低) 相同点 差别 EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶的比较 不同点 相同点 DNA聚合酶 DNA连接酶 连接DNA片段 不需要模板 连接的是游