ELISA的原理与应用重点分析.ppt

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）技术讲座 安徽省动物疫病预防与控制中心 王 非 2009年9月16日 1　抗原 　　抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如完整的病毒粒子、细菌等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇，或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。 2　抗体 抗体的结构 　　抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。 五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。 　重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合 抗原的结构基础。 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。 免疫酶测定法(Enzyme Immuno Assay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶标抗体技术 酶分子与抗原或抗体分子共价结合 酶标抗体与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结合的物质。 滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色。可根据颜色反应来判定有无相应的免疫反应。 颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量成正比。 此种有色产物可用肉眼或分光光度计加以测定。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 3、本次ELISA实验操作解读 猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体 酶联免疫吸附试验 3.2.4　结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。 3.2.5 　结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。 试剂准备 C 酶的底物 3.3 　酶的底物 3.3.1 　HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 E TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇