酵母双杂交系统精要.pptVIP

（二） 转化效率偏低 酵母转化效率较细菌低4个数量级，转化成为双杂交技术的瓶颈。 办法：引进酵母接合型 a接合型和?接合型（两者之间可，但自身不能形成二倍体） （三）阴性干扰 融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？ 应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体 蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。 蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。 (一) 酵母单杂交系统(one-hybrid system) 酵母单杂交系统原理 酵母单杂交系统原理 酵母单杂交系统应用 (二) 反向酵母双杂交系统（ reverse yeast two-hybrid system ） (二) 反向酵母双杂交系统（ reverse yeast two-hybrid system ） 反向酵母双杂交系统的应用 (二)反向酵母双杂交系统（ reverse yeast two-hybrid system ） 1.2.2 用诱饵质粒pGBKT7-HCK2α′筛选文库 (1) 酵母AH109(pGBKT7-HCK2 α′）感受态制备(醋酸锂法） (2) 文库转化（分步转化法) (3) 检测文库转化效率 (4) 初步筛选阳性候选克隆 转化混合物接种在75块SD/-His/-Leu/-Trp培养基中 阳性克隆重新在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上划线培养 β-半乳糖苷酶滤膜影印法初步筛选出阳性候选克隆的转化株 3.3.1 人转换蛋白1的功能及其与蛋白激酶CK2 的关系 转换蛋白(transition proteins,TPs)，主要有转换蛋白1（TP1） 和转换蛋白2（TP2）两种类型。 在精子细胞变态过程中, 核内碱性蛋白质经历了由组蛋白 －转换蛋白－鱼精蛋白的转换过程，精子细胞核由圆形变 为长形, 核高度浓缩。 Tnp1基因缺失鼠的精细胞染色体以异常的形式浓缩，并且DNA 链 断裂增多，成熟的精子形态异常，精子活动力降低。 本实验首次观察到TP1与CK2α′间存在的相互作用，对 研究CK2在精子发生中的功能及可能机制有重要意义。 3.3.2 核酸酶敏感元件结合蛋白1的功能及其与蛋白激酶 CK2的关系 NSEP1是一种细胞周期特异的转录因子，还有YB1、YBX1 、 CSDB、 DBPB 等别名 与细胞增殖有关，具有调节基因的转录、翻译、mRNA剪接及DNA修复等众多功能 通过γ-干扰素信号转导途径(Jak1/CK2/YB-1途径)可激活 YB-1核易位 NSEP-1功能众多，深入研究CK2α′与NSEP-1之间的关系，对了解CK2在精子发生过程中的信号调节具有重要意义 3.3.3 泛素－52氨基酸融合蛋白的功能及其与蛋白激酶CK2的关系 泛素主要通过ATP 依赖性的泛素-蛋白水解酶复合体通路途径高效并高度选择性地对蛋白进行完全或部分降解 这一途经在细胞内许多生理过程，例如细胞周期控制、细胞分化、应激反应、离子通道、DNA的修复、细胞凋亡等过程中起着十分重要的作用 CK2是否通过这一途径参与众多的生物学功能还有待进一步探讨。 3.3.4 核糖体蛋白L37a的功能及其与蛋白激酶 CK2的关系 核糖体蛋白L37a 是核糖体大亚基中一种重要的蛋白质，具有如参与复制、转录、RNA加工、DNA修复、正常细胞的恶性转化及发育调控等重要的核糖体外生理功能。 CK2与核糖体蛋白之间的关系也越来越成为一个具有吸引力的课题 ：已报道核糖体蛋白L22，L5，L41与CK2存在相互作用。本课题组黄功华等也筛选出泛素/核糖体蛋白S27a与CK2α′亚基发生相互作用 3.3.5 NADH脱氢酶4的功能及其与蛋白激 酶CK2的关系 NADH脱氢酶是电子传递链中最重要的黄素蛋白，其基因的高表达可改变膜的通透性，可影响线粒体对细胞凋亡的调节。 本实验表明NADH脱氢酶4与CK2α′之间存在相互作用，这与CK2的物质代谢功能还是与细胞凋亡的功能有关还有待进一步研究。 3.3.6 筛选获得的其它相互作用蛋白 CK2β亚基 17-1#、21-1#文库质粒上的插入片段经序列同源分析，未找到已知蛋白mRNA序列与之相对应，它们的表达产物可能是新蛋白 材料与方法2.1 材料 重组人蛋白激酶CK2α′亚基 陈小文纯化并鉴定 2.2 方法 2