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* 简并引物的设计 简并引物 简并引物：是克隆未知基因的一种引物设计方案。简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA 水平设计引物。由于大多数氨基酸的遗传密码不止一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，就遇到部分碱基的不确定性。这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异，这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。 简并引物设计方法 利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。 因为不同物种的密码子偏好问题，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 对所找到的序列进行多序列比对 将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对 确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个氨基酸为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸。 利用软件设计引物 Primer 5.0 支持简并引物的设计 在线设计：CODEHOP GeneFisher2 对引物的修饰 降低简并度的方法： 通过用次黄嘌呤代替简并度高的碱基 通过密码子偏好选择合适的碱基 利用软件设计引物 Primer 5.0 支持简并引物的设计 在线设计：CODEHOP GeneFisher2 对引物的修饰 降低简并度的方法： 通过密码子偏好选择合适的碱基 通过用次黄嘌呤代替简并度高的碱基 简并引物设计原则 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如甲硫氨酸和色氨酸均只有一个密码子。尽可能不用含有亮氨酸、精氨酸、丝氨酸的肽段。 充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。 引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。 在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。 谢谢观赏 *
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