DNA重排的检测法课件.ppt

DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异，由此可以检测DNA重排 淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果，其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（T细胞受体）的V、D、J、C区基因编码中20 个左右的保守核苷酸序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物，以待测样品DNA为模板，扩增目的DNA序列片段。如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状， 2. 常规PCR技术 不形成单带。 转基因材料外源基因的检测 1,标准分子量；2，质粒；3，对照；4-8，转基因植株 1 2 3 4 5 6 7 8 转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子 (1) PCR-RFLP: 多聚酶链反应(PCR)--限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP) 原理：PCR产物－限制性内切酶切－多态性分 析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。 优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好， 简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析 与比较, 微生物的分群分型分亚型，癌基因 分析，遗传病的诊断等。 局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变 的情况下，一次只能完成一个特定位点突变 筛选，检测效率低。 3. PCR相关技术 PCR-RFLP原理示意 原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。 刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速。 （2）PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism) * * DNA重排的检测方法 马欣荣 高方远 康海歧 一、形态学观察 二、细胞遗传学 如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学 如：荧光原位杂交 四、分子生物学 如： Southern杂交，PCR及相关技术等 一、形态学观察 例子： 上个世纪40年代科学家B．McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的，从而导致转座子的发现。 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。 二、细胞遗传学 染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的 染色体核型分析：观察中期染色体，初步分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加 常规核型分析 荧光核型分析 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY) 光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY) 　　 1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。 优势： 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到 1.5mb 碱基的转位 一次杂交即可分辨人的24条染色体 人染色体光谱核型分析 乳腺癌细胞染色体复杂的畸变 2.染色体显带技术： C-banding 主要染异染色质 R-banding 与C-banding 相反，主要染常 染色质区域 G-banding 是Giemsa 染色结果，产生深 浅不同的条带 Q-banding 是用喹丫因（quinacrine）染 色得到的荧光条带，带型与G带相似 G-带 c. 正常染色体 末端缺失 d. 末端倒位 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位 G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9、10、11染色体间易位，右为异常染色体 三、分子细胞遗传学 原位杂交（In situ hybridisation） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火