DNL细胞制备及瘤机制课件.ppt

DNL细胞制备及抗瘤机制 徐 骎 口腔临床免疫教研室 口腔肿瘤生物实验室 第一部分 DNL细胞的制备 一、概况 口腔颌面部肿瘤——综合序列治疗 免疫治疗是重要手段之一 机体细胞免疫主要执行抗肿瘤免疫效应 抗肿瘤的免疫细胞——NK，LAK，TIL，DNL等 NK——nature killer cells 自然杀伤细胞 LAK——lymphokine activated killer cells 淋巴因子激活的杀伤细胞 TIL——tumor infiltrating lymphocyte 肿瘤浸润性淋巴细胞 DNL——draining lymph node lymphocyte 肿瘤引流区淋巴结细胞 TIL与DNL 相同点 1）邻近肿瘤 2）强大的抗肿瘤效应，比LAK细胞高 50-100倍 3）良好的基因治疗载体 不同点 1）来源不同 2）TIL细胞数量少，易污染 DNL细胞数量多 二、实验目的 1、掌握从淋巴结中分离、培养、扩增 DNL的基本方法 2、明确DNL与TIL的异同点 三、实验材料 1、材料：口腔鳞癌颈清淋巴结 2、器材：显微镜、离心机、超净台、培养皿、 离心管、吸管、培养瓶、尼龙网（200目） 3、试剂：培养液（RPMI1640）、Hank’s液（含 1000u/ml青、链霉素，1000u/ml两性霉素） 四、实验内容 1、DNL的分离 淋巴结 四、实验内容 2、DNL的培养和扩增 1）培养液——RPMI1640+rIL-2 2000u/ml 2）培养条件——DNL 6×106/ml，37℃， 5%CO2 3）3-5天换液，每次换液加入rIL-2 2000 u/ml，细胞浓度保持在6×106/ml 细胞计数 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：自动计数 第二部分 DNL抗瘤机制 以往的研究表明： DNL分泌穿孔素 肿瘤细胞通透性增加 最新研究证实： CTL分泌穿孔素和颗粒酶A（granzyme A） granzyme A激活下游信号传导通路 肿瘤细胞凋亡 DNL体外杀伤口腔鳞癌细胞的作用观察 ——MTT法 原理： 1、MTT——二甲基噻唑二苯基四唑溴盐 2、活细胞线粒体脱氢酶 MTT 结晶形成少，反映活细胞少，杀伤肿瘤细胞作用强 小 结 DNL与TIL异同点 DNL制备方法 DNL抗肿瘤机制 * * 酶消化法—— 0.5%胶原酶Ⅱ、0.02%DNA酶、 0.05%透明质酸酶Ⅳ 机械法 密度梯度离心 DNL 10 9 10 12 [（10+9+10+12）/4]*104=10.25*104/ml(稀释倍数) 不可溶性紫色甲臜 DMSO溶解，检测OD值 MTT结晶 MTT结晶 DMSO溶解结晶 *